一株地衣内生细菌的次生代谢产物研究

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地衣是由真菌与藻类共生形成的稳定复合有机体,能够在极端环境下生长并且广泛地分布全球范围内。在漫长的生物演化过程中,地衣形成了特殊的共生关系,借此能够产生诸多具有生物活性的特有的代谢产物。目前越来越多的研究表明地衣共生系统中存在着大量的细菌群落,主要作用是为地衣体提供氮素营养。它们以α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)为主要类群,呈生物膜的状态分布在地衣体的组织间隙。随着对地衣细菌研究的深入,人们发现细菌群落在地衣系统中有不可替代的作用,并在其次生代谢产物中得到了结构新颖,生物活性很好的化合物。本论文选择的实验样品为根瘤菌目(Rhizobiale)中的新世系LAR1的菌株8433D,是该世系第一个可培养的菌株。首先采用全基因组鸟枪法策略,构建不同插入片段的文库,基于Illumina MiSeq测序平台,利用第二代测序技术对8433D菌株的基因文库进行双末端测序,测序数据经过过滤、整理以及质量评估后去除带有接头、低质量的序列。通过anti SMASH和MiBiG平台将所得序列做基因簇比对,预测可能产生的次生代谢产物以及其生物活性,结果显示该细菌存在与多种抗生素合成相关的关键基因,以及与类胡萝卜素(carotenoids)代谢产物生物合成相关的基因簇。然后对8433D菌株使用PDA培养基大量培养发酵,发酵物经过乙酸乙酯超声萃取后得到粗提浸膏。然后使用乙酸乙酯-石油醚体系进行硅胶柱层析,将浸膏分为七个组分:FrB、FrC、FrD、FrE、FrF、FrG、Fr H。根据七个组分薄层层析的结果,决定对结果清晰,分离效果好的FrD、FrF、Fr G进行葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20、ODS柱色谱和半制备型HPLC处理,分离纯化后共得到七个单体化合物S1-S7。利用核磁共振谱(NMR)、质谱(MS)以及微谱数据比对,结合文献资料,推断出化合物的结构,确定为高丽槐素、酪醇以及五个二肽类化合物,均为已知化合物。全基因组测序技术与天然产物提取技术的结合,为提取地衣细菌中的代谢产物提供了新的思路。通过此方法得到的七个化合物单体均具有一定的生物活性,与基因簇预测的结果结合分析后预测8433D菌株产生肽类抗菌素,为下一步实验做好了铺垫,丰富了有关地衣天然产物的研究数据。
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