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目的:
1.预测人乳头瘤病毒(Humanp papilloma virus,HPV)16型E7蛋白的B细胞表位,可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。
2.通过应用计算机分析方案预测,获得HPV16 E7蛋白候选B细胞表位,并用标准Fmoc方案合成多肽,同时进行纯化、纯度分析,用于动物免疫。
3.将纯化的合成多肽与弗氏完全佐剂完全乳化后分别免疫Balb/c小鼠,制备血清抗体,采用间接ELISA方法鉴定合成多肽的免疫原性。并用HPV16阳性的宫颈癌组织中的HPV16病毒蛋白作为包被抗原,检测合成肽免疫后小鼠产生的血清抗体的效价,以进一步探讨HPV16 E7蛋白候选B细胞表位诱导抗体与HPV抗原结合能力,筛选出HPV16E7蛋白的优势B细胞表位,为高危型HPV16感染肽疫苗的研制提供实验基础。
方法:
1.靶抗原HPV16 E7蛋白氨基酸序列摘自GenBank,采用亲水性方案、柔韧性方案、抗原指数方案及表面可能性方案综合预测HPV16 E7蛋白的B细胞表位,确定候选的B细胞表位。
2.运用标准Fmoc方案合成多肽,合成的多肽经RP-HPLC纯化及纯度分析,并用质谱进行定性鉴定。
3.为鉴定合成的候选表位肽的免疫原性,以合成肽免疫Balb/c小鼠,进行免疫效果评价。实验组(10只/组)分别以3条合成的多肽为免疫原,对照组用蒸馏水,与弗氏完全佐剂按100μg:1ml完全乳化后在小鼠腋下、腹股沟及腹腔多点注射,于0、2、4周共注射3次,首次免疫后第1、3、5周小鼠眶静脉放血采集并制备免疫血清抗体,采用间接ELISA方法进行测定3条多肽在不同免疫时间的抗体效价、免疫原性。
4.收集人宫颈癌标本,筛选出HPV16阳性的标本,超声破膜后提取HPV病毒蛋白,包被酶联板与多肽诱导Balb/c小鼠产生的抗体反应,检测HPV16 E7蛋白候选B细胞表位诱导抗体与HPV抗原结合能力。
结果:
1.四种计算机预测方案分别预测出4条、2条、4条、3条抗原肽表位,综合分析评估,确定P1(HPV16 E714-21)、P2(HPV16 E726-37)、P3(HPV16 E744-51)为HPV16 E7抗原候选B细胞表位。
2.合成的候选表位多肽经RP-HPLC纯化及纯度分析,合成肽的纯度均大于90％,经质谱分析合成肽的分子量测定值与理论值相符。
3.合成的3条多肽免疫Balb/c小鼠后均可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高。经间接ELISA方法检测,候选表位肽均能刺激机体产生抗体；抗体效价随免疫次数增加而升高。
4.人HPV16阳性的宫颈癌组织中HPV抗原与P1肽和P2肽诱导Balb/c小鼠产生的抗体呈阳性反应,与P3肽产生的抗体不呈阳性反应。
结论:
1.预测并筛选了3个可能的HPV16 E7蛋白B细胞表位。
2.通过标准Fmoc方案成功合成了3条多肽,经RP-HPLC纯化及纯度分析,并采用质谱鉴定得到了纯化的候选表位蛋白。
3.合成的3条多肽免疫Balb/c小鼠血清学检测,表明预测的3个B细胞表位蛋白均能刺激机体产生抗体,具有较强的免疫原性,抗体效价随免疫次数增加而升高；而只有HPV16 E714-21和HPV16E726-37表位蛋白诱导所产生的抗体能与HPV16抗原结合,具有较强的免疫原性,可能成为HPV感染肽疫苗的候选表位。