QT间期是指QRS波群起点至T波终点的时间间隔,代表心室除极开始至心室复极结束的时间间期,心室肌细胞膜上各种离子通道有序的开放和关闭是心脏正常电活动的基础,动作电位形状、时程取决于去极化和复极化离子流之间相互的精细平衡,Na+、Ca2+内流使细胞膜去极化,各种外向K+电流使动作电位复极化,心室K+电流主要包括瞬时外向K+电流Ito、ATP敏感钾电流IKATP,延迟整流K+电流及内向整流K+电流IK1,延迟整流K+电流区分为快、慢两种成分IKr和IKs。先天遗传基因改变或后天获得性因素引起心肌离子通道结构和/或功能紊乱,打破动作电位各种离子流之间的精细平衡,从而引起心肌复极延迟或加速,导致QT间期的延长或缩短是诱发心律失常产生的重要原因。自上世纪发现抗心律失常药奎尼丁能引起心脏复极化延迟,引发严重室性心律失常即尖端扭转性室性心动过速(torsade de pointes,Td P)以来,临床发现越来越多的药物会通过阻断复极过程中的外向K+电流,引起心脏复极化延迟导致QT间期延长,复极化过程延迟易诱发早后除极(early after depolarization,EAD)触发异常电兴奋,加上复极离散度增大易发兴奋折返,大大增加心脏发生室性心动过速的危险,最严重的后果是引发尖端扭转性室性心动过速。基于对药物此种潜在致命性威胁的认识,国际人用药物协会(ICH)2004年发布技术指导原则,要求新药研发过程中全面研究药物对QT间期的影响,2014年后我国亦颁布了“药物QT间期延长潜在作用非临床研究技术指导原则”,对新药研发过程相关的非临床安全评价做出了明确要求。近年通过对QT延长药物致心律失常的大量研究,特别是借助于对遗传性LQTs研究的认识,对该类药物引发心律失常的分子、细胞机制基本达成共识。现行的QT延长药物非临床评价模式是以QT的延长作为风险标志物,然而大量的研究表明QT延长本身并不一定与Td P发生完全一致,需要用一些其它敏感、特异性标志物对药物潜在风险高低做出评价。基于延长QT间期药物致心律失常发生分子、细胞机制有人提出动作电位三角形变(triangulation),反向频率使用依赖性(reverse use dependence),QT短期不稳定性(short-term instability)以及跨壁复极离散度(TDR)是药物致心律失常较好的标志物。此外,尚有一些其它标志物如QT/HR间期变异度、i CEB(QT/QRS)等。与上述延长QT间期的药物相反,有些药物促进动作电位复极,具有缩短QT间期的作用。近几年在离子通道药物研究中发现了一些钾通道激动剂,已成功用于神经系统疾病的治疗。与此同时,作用于心肌细胞钾通道的激动剂能够缩短动作电位时程和QT间期,已经报导多种小分子化合物可以特异性的作用于心肌细胞上的各种钾通道,从而引起APD和QT间期缩短。在了解延长QT间期药物致心律失常风险后,显而易见的问题是缩短QT间期药物是否也具有同样的风险?近年临床报道的遗传性SQTs及其相关研究,使人们对此问题有了新的认识。2000年Gussak等人报导了一种以QT间期缩短并伴有恶性心率失常为特征的遗传性疾病,将其命名为short QT syndrome(SQTS)。SQTs在心电图上主要表现为QT间期明显缩短(QTc≤300ms),常伴发心室颤动等恶性心率失常。我们的前期实验证实h ERG通道激动剂ICA-105574具有一定的抗复极延迟所致心律失常作用,但同时能够缩短QT间期和APD,可能具有潜在致心律失常作用,而IKs,IK1,IKATP等特异性钾通道激动剂均有报道能够缩短QT间期和APD,这些激动剂是否具有潜在的致心律失常作用尚不明确。另外,现行的“药物QT间期延长潜在作用非临床研究技术指导原则”以及前已述及的用于评价QT间期延长药物潜在致心律失常发生风险的标志物是否适用于缩短QT间期药物,目前尚无依据和法规支持。国际制药行业亦无相关安全性评价的技术指导原则。因此,对于缩短QT间期药物来讲,建立一套评价其诱发心律失常的评价系统以及寻找能够预测心律失常发生的生物标志物尤为重要。本研究以不同钾通道开放剂为工具药,拟通过Langendorff离体灌流心脏模型、标准玻璃微电极细胞内记录技术、动作电位钳技术,从不同水平结合多种电生理技术,研究心脏不同靶点缩短QT药物的致心律失常风险特征、探讨致心律失常的细胞机制、并寻找致心律失常的风险标志物。研究将为创新药物非临床安全性评价提供新的参考,同时为解释药物致心律失常机制、临床规避药物风险提供实验依据。第一部分 豚鼠和兔离体心脏对缩短QT间期药物敏感性比较目的:观察豚鼠和家兔离体心脏对不同缩短QT间期药物的敏感性异同,并评估缩短QT间期药物潜在致心律失常的风险和类型。方法:利用Langendorff离体心脏灌流技术,选择不同类型的钾通道开放剂:h ERG通道开放剂ICA-105574和NS-1643,IKs开放剂R-L3,ATP敏感钾通道开放剂吡那地尔(Pinacidil)。观察心电图(ECG)各参数的变化,并比较豚鼠和家兔心律失常发生率的异同。实验程序如下:为观察不同浓度钾通道开放剂对心电图各参数的影响,首先心脏稳定一小时以保证记录到稳定可靠的心电图;以含0.1%DMSO的台氏液作为对照溶液灌流心脏30分钟,再按照低、中、高的浓度顺序依次灌流钾通道开放剂,观察钾通道开放剂对两种不同动物种属的致心律失常发生风险和类型。结果:1 h ERG通道开放剂:ICA-105574可浓度依赖性缩短豚鼠QT间期,在高浓度(10μM)缩短程度可达50%以上(n=8,P<0.01),并且引起显著的T波倒置,随之伴发non-Td P-like VT/VF样心律失常,心律失常发生率达62.5%(n=8)。与之相比,ICA-105574同样浓度依赖性的缩短家兔离体心脏QT间期,在10μM对QT间期的缩短程度达46%(n=6,P<0.01),可引起T波倒置并诱发心律失常,发生率为50%(n=6)。NS-1643是作用机制不同于ICA-105574的另外一种h ERG通道开放剂,同样可以浓度依赖性的缩短豚鼠和家兔的QT间期,高浓度时其缩短程度分别可达20%(n=5,P<0.01)和15%(n=5,P<0.05)。值得注意的是在豚鼠心脏模型中心律失常发生率为60%(n=5),在兔离体模型中未见心律失常的发生。2 IKs开放剂:R-L3相比较于上述两种h ERG通道开放剂,对QT间期的缩短程度明显低于二者。高浓度时在豚鼠和兔心脏模型仅缩短15%和7%(n=5),同时可诱发VT/VF,豚鼠心律失常发生率为40%(n=5),在兔离体模型中未见心律失常的发生。3 ATP敏感钾通道开放剂:吡那地尔(Pinacidil)浓度依赖性的缩短豚鼠(n=7)和兔离体心脏QT间期(n=6),30μM Pinacidil在7例豚鼠心脏中诱发了4例产生心律失常,而兔离体心脏中未见有心律失常发生。小结:四种钾通道开放剂可显著缩短豚鼠离体心脏QT间期,并诱发VT/VF;对于兔离体心脏模型而言,只有ICA-105574在高浓度时可诱发VT/VF,其余三种钾通道开放剂并未诱发心律失常。相比较于兔心脏模型,豚鼠心脏模型对钾通道开放剂更为敏感,可作为评估缩短QT间期药物潜在致心律失常风险的动物模型。第二部分缩短QT间期药物对豚鼠离体心电图各参数的影响目的:观察缩短QT间期药物对豚鼠离体心电图各参数的影响,并寻找预测心律失常发生的生物标志物。方法:1利用Langendorff离体心脏灌流技术,将两个电极置于离体心脏的主动脉根部和心尖部,通过BIOPAC/MP150多道生理测定系统记录给予不同浓度缩短QT间期药物后心电图(ECG)的变化,并采用受试者工作曲线对心电图各参数进行分析,寻找预测心律失常发生敏感性和特异性较高的生物标志物。实验程序如下:为观察不同浓度缩短QT间期药物对心电图各参数的影响,首先心脏稳定一小时以保证记录到稳定可靠的心电图;以含0.1%DMSO的台氏液作为对照溶液灌流心脏30分钟,再按照低、中、高的浓度顺序依次灌流缩短QT间期药物,观察给予缩短QT间期药物前后心电图各参数的变化。2受试者工作曲线(ROC curve)是临床诊断常用的一种分析方法,可用于两种或两种以上不同诊断试验对疾病识别能力的比较。在对同一种疾病的两种或两种以上诊断方法进行比较时,可将各个诊断结果的ROC曲线绘制到同一坐标中,以直观的鉴别其诊断价值的高低,靠近左上角的ROC曲线所代表的诊断价值最准确。也可以通过分别计算各个指标的ROC曲线下的面积(AUC)进行比较,曲线下面积(AUC)越大的参数代表其诊断的准确性越高,一般来说AUC>0.9说明该参数具有较高准确性、AUC在0.7-0.9时有一定的准确性、AUC在0.5-0.7时有较低的准确性。结果:1 h ERG通道开放剂:ICA-105574浓度依赖性的显著缩短QT间期、JTpeak间期(代表早期复极时程)、i CEB(QT/QRS的比值)。同时ICA-105574浓度依赖性的增大JT area(代表跨壁复极离散度)。ICA-105574在高浓度(10μM)时QT间期变异度和心率变异度显著增加,8例豚鼠心脏中有5例发生了心律失常。采用受试者工作曲线分析以上ECG各参数,结果显示JTpeak间期、JT area、Tp-e等三个参数的曲线下面积大于0.9,提示上述三个参数预测ICA-105574诱发心律失常的准确度更高。NS-1643在三个测试浓度中均可以浓度依赖性的缩短QT间期和JTpeak间期,在高浓度时(10μM)显著降低i CEB。同ICA-105574一样,NS-1643浓度依赖性的增大JT area。在给予10μM的NS-1643后,5例心脏中3例出现VT或VF,值得注意的是仅在高浓度时PR间期显著延长,提示NS-1643对房室传导可能有一定的阻滞作用。采用受试者工作曲线分析以上ECG各参数,结果显示JTpeak间期、JT area、心率变异度等三个参数的曲线下面积大于0.9,提示上述三个参数预测NS-1643诱发心律失常的准确度更高。2 IKs开放剂:R-L3浓度依赖性的缩短QT间期和JTpeak间期,与NS-1643相似,R-L3只在高浓度(10μM)时降低i CEB。除此之外,JT area随浓度增加而增大,最高可增大至对照的四倍。高浓度R-L3诱发VT/VF的发生率为40%。受试者工作曲线分析以上ECG各参数,结果显示JTpeak间期、JT area两个参数的曲线下面积大于0.9,提示二者预测R-L3诱发心律失常的准确度更高。3 ATP敏感钾通道开放剂:给予不同浓度的Pinacidil后QT间期、JTpeak间期、i CEB均呈浓度依赖性的缩短或降低。与此同时,Tp-e和JT area显著升高。给予20μM的Pinacidil后,7例心脏中的4例发生心律失常。受试者工作曲线分析显示,JTpeak间期、JT area两个参数的曲线下面积大于0.9,提示二者预测Pinacidil诱发心律失常的准确度更高。小结:四种不同类型的钾通道开放剂可不同程度的影响豚鼠离体心电图各参数,ROC曲线分析显示,JTpeak间期的缩短和JT area的增大在能较准确预测钾通道开放剂潜在致心律失常风险。同时,结果提示,加速早期复极和跨壁复极离散度的增大可能是钾通道开放剂诱发心律失常的主要机制。第三部分缩短QT间期药物对豚鼠乳头肌动作电位和电流的影响目的:观察缩短QT间期药物对豚鼠乳头肌动作电位各参数的影响,并探讨其致心律失常的发生机制。方法:1采用标准玻璃微电极细胞内记录技术,记录豚鼠乳头肌动作电位,观察在不同刺激频率下(0.2 Hz、1 Hz、2 Hz)给予不同浓度钾通道开放剂后,动作电位复极化30%时间(APD30,代表动作电位早期复极参数)、动作电位复极化90%时间(APD90)、APD90-30(反映复极中晚期时程)和有效不应期(ERP)以及对豚鼠心肌细胞动作电位频率依赖性的影响。并观察触发活动(早后除极或迟后除极)的发生情况,采用受试者工作曲线对给予缩短QT间期药物前后动作电位各参数进行分析,寻找在动作电位水平能预测触发活动发生的标志物。2在急性分离的心肌细胞上,利用动作电位钳技术,观察四种缩短QT间期药物对心肌细胞复极过程中外向电流的影响。首先,在豚鼠心室肌细胞上,电流钳模式下记录动作电位,以此记录到的动作电位波形作为刺激protocol记录复极过程中外向钾电流的变化。记录外向电流的溶液:电极内液(mmol/L):KCl 140,Mg-ATP 4,Mg Cl2 1,EGTA 5,HEPES 10,用KOH调p H至7.2。电极外液(mmol/L):NMG 130,KCl 5.4,Mg Cl2 1,Ca Cl2 2,glucose 10,HEPES 10用Na OH调p H至7.4。Cd Cl2(300μM)加入到外液中阻断钙电流。3在急性分离的心肌细胞上,利用动作电位钳技术,观察四种缩短QT间期药物对心肌细胞复极过程中内向电流的影响。单个室性动作电位波刺激诱发内向电流。记录内向电流的溶液:电极内液(mmol/L):Cs OH 70,aspartic acid 80,Cs Cl 40,Na Cl 10,Mg Cl2 2,HEPES 10,EGTA 10,Mg ATP 5,Na2GTP 0.2,Na2-phosphocreatine 4,用Cs OH调p H至7.2。电极外液(mmol/L):Na Cl 130,Cs Cl 5.4,Mg Cl2 1,Ca Cl2 2,glucose 10,HEPES 10用Na OH调p H至7.4。结果:1首先,我们考察了四种钾通道开放剂对动作电位反向使用频率依赖性的影响,结果显示:在高中低三个浓度,均不影响动作电位的频率依赖性。2动作电位各参数的变化:为了更直观的观察钾通道开放剂作用于心肌复极过程中哪一时期,我们对复极时程进行分段考量即:APD30和APD90-30。在2Hz刺激频率下,四种钾通道开放剂均可浓度依赖性的缩短APD90、APD30和有效不应期(ERP),除高浓度Pinacidil外,另外三种钾通道开放剂对APD90-30均无显著影响。3 EAD或DAD发生率:我们考察了在三个刺激频率0.2 Hz、1 Hz、2 Hz刺激下触发活动的发生情况,结果显示:在0.2Hz和1Hz刺激下未见EAD或DAD发生;在2Hz刺激下,除Pinacidil外,其余三种钾通道开放剂在高浓度时均诱发EAD或DAD的发生。其中,给予10μM ICA-105574后,6例标本中4例出现EAD现象,而且EAD发生在复极早期阶段;10μM NS-1643可诱发5例标本中4例出现DAD;IKs开放剂R-L3诱发DAD的发生率高达100%,5例标本在2Hz刺激条件下全部发生DAD。4受试者工作曲线分析动作电位各参数:对以上各动作电位参数进行分析,结果显示:APD90和APD30两个参数的曲线下面积大于0.9,提示,二者预测ICA-105574、NS-1643和R-L3诱发EAD/DAD的准确度更高。值得注意的是,三种钾通道开放剂的APD90和APD30两个参数曲线下面积完全相同即二者预测能力完全相同,提示我们,APD90的缩短可能来自于APD30的贡献更多。5四种钾通道开放剂对复极过程中外向钾电流的影响:四种钾通道开放剂均可浓度依赖性的增加早期复极过程外向电流的幅度,然而增加的方式却不尽相同,ICA-105574对电流的增加主要集中在APD30时程下,呈现“穹顶”式增加;NS-1643则是“爬坡”式增加外向电流;IKs开放剂R-L3对外向电流的增大方式与ICA-15574相似,但是增幅要小于ICA-105574;Pinacidil均匀增加整个复极过程中外向电流的幅值,这也可能是其未诱发EAD或DAD的原因所在。接下来我们又在急性分离的豚鼠心室肌细胞上验证了钾通道开放剂对复极过程中内向电流的影响,结果显示,四种钾通道开放剂对内向电流无显著作用。说明钾通道开放剂引起的QT和APD的缩短没有内向电流的参与。