论文部分内容阅读
诱导多能性干细胞技术是指通过特定重编程因子的表达将完全分化的成体细胞重新编程为类似胚胎状态的全能性或多能性的细胞技术。现有的重编程因子导入技术无论是病毒性载体还是非病毒性载体,都存在安全性或者效率低等缺点,无法满足科研和临床应用。因此开发一种新的安全高效的重编程因子导入技术是十分必要的。
细胞穿透肽是一类少于30个氨基酸的短肽,它们能穿过细胞膜并携带多种外源生物活性分子进入细胞。本课题将利用HIV-1病毒Tat蛋白改造所得的细胞穿透肽Tat-LK15建立一种重编程因子导入新技术。
本课题首先以Tat-LK15作为载体,使其结合携带荧光报告质粒pCEP4-GFP进入细胞,通过对报告质粒的Cy5标记和荧光显微镜观察,验证了Tat-LK15可以把外源性质粒导入目的细胞并获得外源基因的表达。之后,以Tat-LK15作为载体,把表达Oct4,Sox2,K1f4和c-Myc四种重编程因子的一组质粒分别或一起导入细胞,通过对质粒的Cy5标记、PCR检测和Western Blot验证,证明Tat-LK15可以成功实现重编程因子的导入和表达。
本论文也发展了Tat-LK15介导的mRNA导入新技术。首先体外设计合成EGFP mRNA,以Tat-LK15为载体,携带其进入细胞并实现了荧光蛋白EGFP的表达。之后,体外合成四种重编程因子Oct4,Sox2,K1f4和c-Myc的mRNA,Tat-LK15作为载体携带四种重编程因子的mRNA进入细胞,通过RT-PCR检测,证明Tat-LK15成功把重编程因子的mRNA导入目的细胞。
综上,本论文初步建立了细胞穿透肽Tat-LK15介导的外源性质粒和mRNA导入新技术,并成功用于质粒形式和mRNA形式的诱导多能性干细胞重编程因子导入及表达。本研究为发展新的安全高效的重编程因子导入技术提供了新思路。而且该技术不会引起外源性的基因组整合,安全性较高。同时该技术具有和脂质体转染相类似的导入效率,在基础科研和临床试验方面具有良好的应用前景。