蛋白质和肽类药物口服给药一直是药剂学研究的热点和难点,也是医药领域最具挑战的前沿课题之一。然而,若要实现有效的口服递送,必须克服该类药物稳定性差、胃肠道酶降解、膜渗透性差等多重障碍。近年来,以胰岛素为主要模型药物,发展了尤其包括纳米递送系统在内的多种促进吸收策略。然而,目前的研究现状表明在提高胰岛素口服生物利用度方面似乎遇到了一个瓶颈,因此亟待探索新的方法和策略以进一步增强这些纳米给药系统促进吸收的作用。本文的主要学术思路在于以生物素(biotin)修饰脂质体,藉胃肠道上皮的生物素受体介导的内吞机制,促进胰岛素的口服吸收,并对其口服吸收机制进行探索与验证。脂质体的生物素化通过在脂质体双分子层膜上嵌入生物素-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(biotin-DSPE)而达成。Biotin-DSPE通过生物素的羧基与DSPE氨基的酰胺化反应合成,产物的结构经TLC、FTIR和1HNMR分析验证。采用逆向蒸发/超声分散法制备载胰岛素生物素化脂质体,以包封率和粒径为指标,分别考察了药物/脂质比、磷脂/胆固醇比、初乳制备时有机相/水相体积比和脂质体水化时介质pH值等影响因素,对制备条件进行优化。优选条件下制备的生物素化脂质体胰岛素包封率可达30%以上,脂质体粒径在150nm左右。圆二色谱(CD)检测结果表明在各极端制备条件下制备的脂质体,胰岛素的二级构象保持完好；大鼠皮下降糖实验表明,制剂中胰岛素的降糖作用与胰岛素溶液无显著性差异,表明胰岛素的生物活性亦得以保存。生物素化可显著提高脂质体的相变温度,当biotin-DSPE占脂质比例的20%以上时,其相变温度可以达到40℃以上。相对于普通脂质体,生物素化脂质体的体外抗胃肠道酶解能力较强；4℃下短期放置其包封率和粒径变化较小,表明其稳定性较好。正常大鼠模型上验证了生物素化脂质体的口服降血糖作用及其影响因素,并在高血糖大鼠模型上考察了生物素化脂质体口服给药后的大鼠体内血糖下降水平和血浆中胰岛素浓度变化。结果表明,在正常大鼠体内生物素化脂质体比普通脂质体具有更加明显的降血糖作用,其相对药理生物利用度为11.04%,而普通脂质体仅为2.09%。在对生物素化脂质体口服降血糖作用的影响因素考察中发现150nm左右粒径的脂质体粒径具有较好的体内降血糖效应,脂质体中biotin-DSPE比例在20%以上时体内降血糖效应无显著性差异,在低剂量下脂质体降血糖效应具有剂量依赖性,高剂量下则具有非线性特点；高血糖大鼠体内相对药理生物利用度则达到12.09%,普通脂质体为6.36%；基于血浆胰岛素水平的生物利用度为8.41%,而普通脂质体仅有3.44%。结果表明生物素化脂质体能够显著地促进胰岛素的口服吸收,其作用温和持久。吸收机制研究方面,首先在Caco-2细胞模型上验证了胃肠道吸收上皮生物素受体表达。在细胞水平上进行了胰岛素生物素化脂质体在Caco-2细胞单层上的跨膜转运研究,并通过TEER值的测定和CLSM观察考察了脂质体对Caco-2细胞单层生理功能和紧密连接的影响,结果表明胰岛素在脂质体的介导下其跨膜转运能力得到显著改善,尤其是生物素修饰脂质体,其表观渗透系数(Papp)是普通脂质体的1.87倍；脂质体对细胞紧密连接无显著的影响。脂质体的细胞摄取研究表明脂质体生物素化后促进了标记物的细胞摄取量以及脂质体的内化,并具有温度依赖性和与生物素竞争抑制性,这表明生物素化脂质体与普通脂质体之间存在不同的细胞摄取机制。在随后的细胞内吞机制研究中发现,生物素化脂质体的内化是通过网格蛋白介导的内吞(clathrin-mediated endocytosis)途径实现的,这些结果说明生物素化脂质体的吸收是有生物素配体介导的、消耗能量的内吞转运过程。CLSM荧光共区域化研究表明,脂质体是以完整纳米粒进入细胞的,在细胞内经历了早期内含体、后期内含体和溶酶体的递送过程,这是受体介导内吞典型的转运特征。在组织水平上,还进行了脂质体胃肠道转运的实时离体成像观察和跨上皮吸收的免疫荧光观察,离体成像研究表明生物素化脂质体在胃肠道中具有较快的转运速率,荧光免疫组化分析也表明了生物素化脂质体具有更好的上皮细胞膜渗透性。因而,对吸收机制研究结果总结如下：生物素化脂质体促进胰岛素口服吸收的机制主要是通过细胞通路途径(transcellular)由生物素配体介导的内吞机制,而不是通过细胞旁路途径(paracellular)打开细胞间紧密连接机制。尽管胃肠道对生物素化脂质体的吸收主要由受体介导的内吞完成的,但它的吸收是一个协同的过程,可能还伴随着经M-细胞吸收的淋巴转运过程,这是基于脂质体纳米给药系统本身的贡献。通过MTT细胞活力测定和细胞凋亡实验考察了脂质体对细胞活力和细胞凋亡的影响,结果表明生物素化脂质体基本没有毒性,口服安全性良好。本文通过在脂质体膜上嵌入Biotin-DSPE,成功地构建了一种新型的生物素化胰岛素口服递送系统。该系统显著地提高了胰岛素的口服生物利用度,具有潜在的应用价值,也为蛋白质和多肽类药物口服给药系统的研究与开发提供了新的思路。