干扰素（Interferon,IFN）是一组具有广泛抗病毒活性和免疫调节功能的细胞因子,根据其染色体定位、基因结构、序列相似性和识别的受体,哺乳动物的干扰素分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。其中,γ干扰素是Ⅱ型干扰素的唯一成员,主要由激活T淋巴细胞和自然杀伤细胞表达,在获得性免疫中发挥重要作用。Ⅰ型和Ⅲ型干扰素具有多个亚型和相似的抗病毒活性,在先天性免疫中发挥关键作用。在Ⅰ型干扰素中,研究最多的是α干扰素（IFN-α）和β干扰素（IFN-β）,其中IFN-α具有10多个亚型,而IFN-β仅有1个亚型。猪干扰素（Porcineinterferon,PoIFN）具有60多个功能基因,是研究动物家养驯化过程中病毒压力导致的干扰素进化的理想模型。其中,猪Ⅰ型干扰素至少有39个功能基因,编码17个PoIFN-α亚型、11个PoIFN-δ亚型、7个PoIFN-ω亚型以及1个PoIFN-β、PoIFN-ε、PoIFN-κ和PoIFN-αω亚型,但不同亚型干扰素的组织差异表达和抗病毒活性的比较研究很少。小型猪具有遗传背景相对稳定、饲养成本较低和实验操作方便等优点。版纳小型猪是世界上第一个培育成功的实验小型猪近交系,通过滇南小耳猪半同胞近交培育而成,具有清楚的遗传背景和很小的个体差异。巴马小型猪来源于广西巴马香猪,已有多家单位引种并培育成实验用小型猪品系,具有体型小、繁殖性能好、遗传稳定等特点。这些小型猪品系已广泛用于异体移植、药物毒性、病毒感染和疫苗评价等生物学研究,但分子水平的基础研究很少。与长期驯化的家猪相比,小型猪的驯化程度较低,经受的病毒压力不同,疾病抗性也有差异,主要与先天性免疫有关。干扰素是先天性免疫的重要执行者,但小型猪的干扰素几无研究。为了促进我国小型猪的科学利用,本研究对巴马小型猪和版纳小型猪的部分Ⅰ型干扰素的基因克隆、序列分析、组织差异表达和抗病毒活性进行了比较研究。1.巴马小型猪的PoIFN-αω基因克隆、组织差异表达与抗病毒活性研究IFN-αω是新发现的一种Ⅰ型干扰素,家猪的PoIFN-αω基因克隆和抗病毒活性已有报道,但在小型猪尚无研究报道。本研究从巴马小型猪的不同组织抽提总RNA,根据家猪PoIFN-αω基因序列设计引物,利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行PoIFN-αω基因克隆;将扩增序列插入质粒载体后进行双向测序,将所序列与家猪PoIFN-αω序列进行比对分析;利用荧光定量RT-PCR进行PoIFN-αω基因的组织差异表达测定,将其组织表达谱与家猪PoIFN-αω进行比较分析;将克隆的PoIFN-αω基因插入原核表达载体,转化大肠杆菌后进行IPTG诱导表达;利用镍亲和柱纯化融合蛋白,用针对纯化标签的单克隆抗体进行免疫转印鉴定;分别以猪水泡性口炎病毒（;VSV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为指示病毒,利用细胞病变（CPE）抑制试验进行抗病毒活性测定。结果显示:从巴马小型猪皮肤、肝、脾和肺克隆的PoIFN-αω cDNA均为558bp,24个克隆的测定序列与家猪PoIFN-αω相同,编码185个氨基酸的多肽,前23个氨基酸为信号肽,成熟肽含有1个潜在的N糖基化位点、4个与结构稳定有关的半胱氨酸和多个α干扰素受体结合位点。在测定的10种不同组织中,脾、肾、小肠和淋巴结的PoIFN-αω基因表达水平较高（表达指数大于1.0）,皮肤、心脏、子宫、肝、肺和脑的PoIFN-αω表达水平较低（表达指数小于1.0）,与家猪PoIFN-αω的组织表达谱有显著差异。重组大肠杆菌表达的组氨酸标签融合PoIFN-αω为21kDa可溶性蛋白,镍亲和柱纯化的重组蛋白为单一条带,能被组氨酸标签特异性单克隆抗体识别。纯化的重组PoIFN-αω对VSV、PRV和PRRSV均有较强的感染前和感染后抗病毒活性,细胞病变抑制具有剂量依赖性,但对PCV2无明显的抗病毒活性,可能与PCV2基因组存在干扰素应答序列有关。这些研究结果表明巴马小型猪PoIFN-αω的组织差异表达和抗病毒活性与家猪PoIFN-αω有明显差异,可能与饲养环境或免疫状态有关。2.两种小型猪的β干扰素基因克隆、组织差异表达与抗病毒活性研究尽管PoIFN-β的基因克隆在家猪、从江小型香猪、非洲小型猪和非洲野猪已有报道,但尚未开展组织差异表达和抗病毒活性的比较研究,巴马和版纳小型猪的PoIFN-β基因序列尚无报道。本研究分别从巴马小型猪和版纳小型猪的不同组织抽提基因组DNA和RNA,根据家猪PoIFN-β基因序列设计引物,利用高保真PCR进行PoIFN-β基因及其启动子序列克隆;将扩增产物插入质粒载体后进行双向序列测定,将所获序列与不同种动物的PoIFN-β序列进行序列比对分析;利用荧光定量RT-PCR进行组织差异表达检测;将克隆的PoIFN-β基因插入原核表达载体,转化大肠杆菌后进行IPTG诱导表达;利用镍亲和柱纯化融合蛋白,用纯化标签特异性单克隆抗体进行免疫转印鉴定;分别以VSV、PRV和PRRSV为指示病毒,利用细胞病变抑制法测定重组PoIFN-β的抗病毒活性。结果显示:从两种小型猪克隆的PoIFN-β基因均为561bp,编码186个氨基酸的多肽,前21个氨基酸为信号肽,成熟肽含3个保守的半胱氨酸和1个潜在的N糖基化位点。与家猪、从江小型香猪、非洲小型猪和3种非洲野猪相比,两种小型猪的PoIFN-β核苷酸序列同源性为97.9%～100%,氨基酸序列同源性为98.4%～100%;所有品种猪的PoIFN-β启动子调节结构域（PRD）相同,包括PRDⅠ和PRDⅢ 中的 IRF3 和 IRF7、PRDⅡ 中的 NF-kB、PRDⅣ 中的 ATF 和 Jun。在检测的 10种不同组织中,两种小型猪的PoIFN-β基因表达谱有显著差异,也与家猪PoIFN-β的组织表达不同;版纳小型猪的高表达组织为肝和肺,巴马小型猪的高表达组织为肺;版纳小型猪的皮肤、心、肾和脑组织未检测到PoIFN-β基因表达,巴马小型猪的皮肤未检测到PoIFN-β基因表达。重组大肠杆菌表达的重组PoIFN-β为21kDa可溶性蛋白,镍亲和柱纯化的重组蛋白为单一条带,能被组氨酸标签特异性单克隆抗体识别。重组PoIFN-β对VSV、PRV和PRRSV均有较强的感染前和感染后抗病毒活性,细胞病变抑制具有剂量依赖性,与家猪PoIFN-β的抗病毒活性有明显差异。这些研究结果表明猪科动物的PoIFN-β基因具有高度保守性,但不同猪种的组织表达谱具有显著差异,可能与猪的饲养环境或免疫状态有关。3.巴马小型猪α干扰素亚型的基因克隆、组织差异表达与抗病毒活性研究家猪PoIFN-α具有17个亚型,其基因序列、组织差异表达和抗病毒活性已有研究报道,但在所有小型猪均无研究报道。本研究从巴马小型猪的不同组织抽提DNA和RNA,根据不同亚型的家猪PoIFN-α基因序列设计引物,利用PCR或RT-PCR进行PoIFN-α cDNA及其启动子序列克隆;将扩增产物插入质粒载体后进行双向序列测定,将所获序列与家猪PoIFN-α序列进行同源性比对分析;利用荧光定量RT-PCR进行不同亚型的PoIFN-α基因组织差异表达检测,将其组织表达谱与不同亚型的家猪PoIFN-α进行比较分析;将克隆的不同亚型PoIFN-α基因插入真核表达载体,转染真核细胞后进行表达检测;利用镍亲和柱纯化重组蛋白,利用纯化标签的特异性单克隆抗体进行免疫学鉴定;分别以VSV、PRV和PRRSV为指示病毒,利用细胞病变抑制试验进行不同亚型PoIFN-α的抗病毒活性检测。结果显示:利用PoIFN-α亚型通用引物可从巴马小型猪的肝、脾、肺和小肠混合样品中扩增出546bp和570bp的cDNA,转化大肠杆菌后挑取121个克隆进行序列测定,共获得7个一致序列,与家猪PoIFN-α1、PoIFN-α2、PoIFN-α8、PoIFN-α10、PoIFN-α12、PoIFN-α13 和 PoIFN-α16 的核苷酸序列同源性为99%～100%,氨基酸序列同源性为98%～100%;利用PoIFN-α7/11基因特异引物扩增的cDNA为546bp,插入质粒载体后进行序列测定,共获得2个一致序列,与家猪PoIFN-α7/11的序列同源性为99%～100%;利用PoIFN-α14基因特异引物扩增的cDNA为570bp,与家猪PoIFN-α14的序列同源性为99%～100%;利用亚型通用引物从基因组DNA扩增出其余7个亚型PoIFN-α基因,与家猪PoIFN-α3、PoIFN-α4、PoIFN-α5、PoIFN-α6、PoIFN-α9、PoIFN-α15 和 PoIFN-α17 的同源性为98%～100%。完整PoIFN-α开放阅读框编码189个氨基酸的多肽,较短阅读框的C端有8个氨基酸缺失;不同亚型PoIFN-α的核苷酸序列同源性为96.3%～99.8%,氨基酸序列同源性为92.3%～99.5%;所有PoIFN-α亚型前23个氨基酸为信号肽,成熟肽含有4个保守的半胱氨酸和1个潜在的N糖基化位点。利用PoIFN-α启动子PCR引物从基因组DNA扩增得98bp和116bp PCR产物,转化大肠杆菌后挑取27个克隆进行序列测定,共获得9个一致序列,其4个启动子结构域与家猪PoIFN-α的启动子相同,包括IRF3、IRF7和“TATA”框。在测定的10种不同组织中,17个PoIFN-α亚型的组织表达谱有显著差异,淋巴结和脾脏为多亚型、高表达组织,心、肺、脑和小肠为个别亚型、低表达组织。从重组表达载体转染细胞纯化获得了 17个亚型的重组PoIFN-α,能被纯化标签的特异性单克隆抗体识别。不同PoIFN-α亚型具有不同的抗病毒活性;在低剂量条件下,PoIFN-α6的抗VSV和抗PRRSV活性最强,PoIFN-α5的抗PRV活性最强,PoIFN-α3对3种病毒的病变抑制作用最弱;在高剂量条件下,PoIFN-α6 和 PoIFN-α14 的抗 VSV 活性最强,PoIFN-α5 和 PoIFN-α7 的抗 PRV 活性最强,PoIFN-α14 的抗 PRRSV 活性最强,PoIFN-α3、PoIFN-α6 和 PoIFN-α12 的抗病毒活性具有明显的剂量依赖性;巴马小型猪PoIFN-α亚型的抗病毒作用与家猪明显不同。这些研究结果表明不同猪种的PoIFN-α亚型具有高度的序列保守性,但组织表达谱和抗病毒活性具有显著差异,可能与饲养环境、免疫状态或检测方法有关。4.版纳小型猪α干扰素亚型的基因克隆及差异表达研究本研究从版纳小型猪的不同组织提取细胞RNA,利用PoIFN-α亚型通用引物从脾脏、肝、肺和肠混合cDNA扩增546bp和570bp的cDNA。将扩增产物克隆入PCR克隆载体,挑取171个克隆进行双向测序,共获得17个一致序列,与家猪17个PoIFN-α亚型的核苷酸序列同源性为98%-99.9%,氨基酸序列同源性为95～100%。与家猪和巴马小型猪一样,版纳小型猪的PoIFN-α完整ORF编码189aa的多肽,C端缺失24个碱基的ORF编码181aa的多肽。所有多肽的前23个氨基酸为信号肽,成熟肽的第一个残基均为半胱氨酸,其它3个保守的半胱氨酸分别位于29、99和139位氨基酸,78为氨基酸为潜在的N糖基化位点,不同PoIFN-α亚型的核苷酸序列同源性在96.3%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在92.3%～99.5%之间。实时荧光定量RT-PCR检测显示,版纳小型猪PoIFN-α亚型的组织表达谱与巴马小型猪有所不同,尽管两种小型猪的淋巴结和脾脏均为多亚型、高表达组织,心脏和脑组织为低表达组织,但版纳小型猪的皮肤、肺和小肠为多亚型、高表达组织,而巴马小型猪的3种组织仅有个别亚型PoIFN-α低水平表达。鉴于PoIFN-α启动子的高度保守性,相同饲养条件下的两种小型猪的PoIFN-α亚型差异表达的具体原因有待进一步研究。总之,本研究首次克隆了巴马小型猪的PoIFN-αω cDNA、巴马小型猪和版纳小型猪的PoIFN-β cDNA及其启动子序列以及巴马和版纳小型猪的17个亚型PoIFN-α基因,比较系统地分析比较了这些基因的组织差异表达和抗病毒活性,为我国小型猪的科学利用和抗病机制研究打下了良好基础。