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炎症是机体的一种自我保护机制,目的在于清除异物,回复机体稳态。在炎症起始阶段,局部炎症因子招募白细胞,随着炎症进展,炎性细胞和炎性因子等逐步清除局部病原体等,炎症进入消退阶段。在该阶段,中性粒细胞发生凋亡,巨噬细胞吞噬清除凋亡细胞和细菌等,并分泌炎症抑制因子和促组织修复分子,终止炎性反应并促进组织回复稳态,该过程即为炎症消退。研究发现炎症消退是一个主动过程。这一过程涉及到促炎症消退分子的合成,炎症起始阶段的因素可促进促炎症消退分子合成,后者通常通过促进巨噬细胞吞噬清除凋亡细胞、促进巨噬细胞低炎症性的吞噬清除细菌等机制而促进炎症消退。炎症消退是炎症自身反馈性调控机制,也是炎症自限的主要原因。 感染性炎症在炎症中常见,是世界范围内导致死亡的主要原因之一,特别是细菌感染,在临床上常见。目前治疗细菌感染的普遍方法是抗生素的使用,但随着耐药菌的增加,迫切需要新的治疗策略。促感染性炎症消退分子可在促进细菌等清除同时促进组织回复稳态,有望提供抗感染新策略和新药物,因此研究发现新促感染性炎症消退分子并阐明其机制,具重要意义。 促红细胞生成素(EPO)是机体最重要的促造血因子,在临床上广泛用于治疗多种原因导致的贫血,但近年来的研究发现EPO有除促进造血的多种功能。采用酵母聚糖(zymosan A)诱导的无菌性腹膜炎,我们前期研究首次发现,炎症反应可诱导局部EPO 表达上升,EPO通过促进巨噬细胞吞噬清除凋亡细胞和异物而促进局部炎症消退,EPO 是机体内源性的促炎症消退分子。但EPO是否可促进感染性炎症消退尚不明确,本课题拟对此进行研究。 大肠杆菌(E.cloi)感染为临床常见疾病,并且大肠杆菌诱导的小鼠腹膜炎模型炎症事件明确,可反映急性炎症从起始、进展到消退的全生理过程;制备简单,重复性好,检测方法相对容易,被广泛用于研究感染性炎症消退生理过程和发现新促细菌感染性炎症消退机制/分子。因此我们拟采用大肠杆菌诱导的小鼠腹膜炎模型,探究EPO在细菌性炎症中的表达情况及其在细菌性感染炎症消退中的作用,期望为细菌性感染的治疗提供新策略和新候选分子。 方法:本研究将通过构建105 c.f.u.大肠杆菌诱导的小鼠自限性细菌性腹膜炎,利用ELISA、流式细胞术探究EPO和促红细胞生成素受体(EPOR)的表达。进一步利用巨噬细胞EPO受体特异性敲除等小鼠,在大肠杆菌诱导腹膜炎模型中,于0小时、6小时、12小时、24小时、48小时检测炎性细胞数目变化情况,绘制炎性消退曲线,比较炎性消退指数。检测腹腔炎性因子浸润情况,检测小鼠体温改变,比较24小时小鼠血液、腹腔细菌铺板数目,从而明确内源性EPO在自限性细菌性炎症中所起到的作用。最后采用外源性EPO干预,进一步明确EPO能否作为新型促消退分子促进细菌性炎症消退。 结果:在第一部分的研究中,我们采用低剂量(105 c.f.u.)大肠杆菌单次腹腔注射,以诱导小鼠自限性、感染性腹膜炎。在该模型中,腹腔中性粒细胞(PMN)浸润在0到12小时不断增加,12小时达到最大值((4.8±0.4)*106),随后开始下降,反映炎症开始消退;在约30小时,PMN细胞数目降到最高值的一半,消退间隔时间为18小时。而巨噬细胞数目0到48小时在小鼠腹腔的浸润整体呈现为不断增加趋势。腹腔炎性细胞浸润时间变化曲线显示了低剂量大肠杆菌诱导小鼠感染性腹膜炎炎症起始、发展和消退过程,反映了该感染性腹膜炎的自限性。同时我们检测了炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1、INF-γ、IL-12p70、IL-10的时间表达变化,发现促炎因子IL-6、TNF-α、MCP-1、INF-γ、IL-12p70在0到12小时浸润不断增加,随后开始下调,在48小时几乎达到正常;而炎症抑制因子IL-10在大肠杆菌注射后24小时显著上升。腹腔炎症因子水平变化进一步反映了我们建立的感染性炎症模型的自限性。 第二部分的研究中,我们检测了低剂量(105 c.f.u.)大肠杆菌诱导小鼠自限性、感染性腹膜炎中EPO相关分子的表达情况。ELISA检测0、6、12、24以及48小时腹腔渗出液中EPO的浓度,表明在大肠杆菌注射后腹腔EPO的表达显著升高,并且随着时间而增加,在 24 小时达到峰值(2200pg/ml)。采用流式细胞技术,我们进一步检测了与EPO作用高度保守的EPO受体表达,结果表明EPOR表达在腹腔巨噬细胞上,而并不表达在PMN上。 第三部分的研究中,我们对内源性和外源性EPO在感染性炎症消退中所起的作用进行了探究。采用低剂量(105 c.f.u.)大肠杆菌诱导巨噬细胞特异EPOR敲除小鼠(EPOR-cKO)小鼠感染性腹膜炎,我们研究了内源性EPO通路对感染性炎症消退作用。与野生型小鼠比较,巨噬细胞EPO信号通路激活的缺失显著延缓了小鼠腹腔炎症消退,表现为EPOR-cKO 小鼠腹腔PMN浸润时间显著延长,消退间隔由18小时延迟至30小时;腹腔炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1、INF-γ和IL-12p70浓度显著升高,而炎症抑制因子IL-10浓度显著降低;EPOR-cKO小鼠血液和腹腔24小时细菌铺板相对于对照组有显著增加,细菌清除能力下降,清除速度减慢。除此之外,EPOR-cKO小鼠体温调控能力显著下降。上述结果提示内源性EPO通路在促进感染性炎症消退起着重要作用。进一步,采用低剂量(105 c.f.u.)大肠杆菌诱导小鼠腹膜炎模型,我们研究了外源性EPO对感染性炎症消退的作用。与对照组比较,给予外源性EPO显著促进了小鼠腹腔炎症消退,表现为EPO降低了小鼠腹腔PMN浸润强度,消退间隔由18小时缩减为11小时;腹腔炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1、INF-γ和IL-12p70浓度显著降低,而炎症抑制因子IL-10浓度显著升高;同时给予EPO也降低了小鼠血液和腹腔 24 小时细菌铺板,表明细菌清除能力增强,清除速度加快。除此之外,外源性EPO也增强了小鼠体温调控能力。上述结果提示外源性EPO可促进感染性炎症消退。 结论:在大肠杆菌诱导感染性腹膜炎中,EPO相关分子表达增加,EPO受体表达在巨噬细胞表面而不表达在PMN细胞表面。内、外源性EPO均促进了感染性性腹膜炎炎症消退,促进了小鼠体内细菌的清除。