光快门漂白进样—固定化酶技术连用的毛细管电泳高时间分辨在线酶反应研究

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本论文提出并建立了一种以毛细管电泳为基础的在线酶分析检测实验平台,将一种新型的微进样技术--光快门漂白进样技术与在线毛细管电泳酶分析技术结合,对酶活性和酶反应动力学进行在线测定和研究,快速、准确、高效地获得酶反应及酶抑制反应的动力学数据。利用该实验平台,我们实现了对胰酶切蛋白酶反应全程的高时间分辨的在线测量。研究表明,光快门进样技术具有少量进样的精确和多次进样的重现性等优点,同时突破了激光诱导荧光检测对反应底物的苛刻要求,结合在线毛细管电泳酶分析技术,该酶分析实验平台提高了酶活性和酶反应动力学测定准确性,帮助我们深入了解酶活性和酶反应动力学机制,以及实现酶抑制剂的高通量筛选,对生物酶学以及抑制剂类药物的研发具有重要的实验意义和应用价值。本论文的研究工作主要集中在以下几个部分:(1)搭建实验方法中的OGVCE-LIF装置,合理实现光快门漂白进样装置和激光诱导荧光检测装置的结合。(2)利用OGVCE-LIF装置首先用于分析荧光标记的血管紧张肽和酶反应产物(FAM-Asp-Arg-OH)的标准样品,检验方法可行性并为后续的酶反应的定量检测绘制校准曲线。(3)利用OGVCE-LIF装置高时间分辨率在线全自动检测固定化胰蛋白酶裂解荧光衍生后的血管紧张肽反应,进而得到该反应的反应速率和反应动力学米氏常数。(4)通过同样方法、手段分析检测胰蛋白酶的可逆竞争性抑制剂和不可逆抑制剂对该酶催化反应的影响。
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