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基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV）是一种通过伊蚊传播的甲病毒,它在非洲、南亚、东南亚等地区周期性暴发,感染率极高[1]。CHIKV感染导致基孔肯雅热（Chikungunya fever,CHIKF）,患者会出现包括高热、关节疼痛、皮疹等临床症状,严重者可导致死亡[2]。CHIKV已在全球100多个国家和地区出现,造成全球范围内每年大约100万人感染[3]。2017年,WHO发布了10种优先研究的潜在传染病,CHIKF榜上有名。目前,尚无针对此病毒的疫苗和药物上市。由于研究CHIKV所需的实验室生物安全等级高,缺乏经济有效的动物模型,限制了针对此病毒的药物和疫苗研发。本课题的设计思路是构建高滴度的CHIKV假病毒,并建立可视化的假病毒小鼠感染模型,继而建立一套安全、全面、合理的体内外中和抗体检测方法,从而可在BSL-2实验室环境下,对疫苗有效性进行评价。本研究利用密码子优化后的CHIKV膜蛋白表达质粒pCMV3.1-CHIKV进行假病毒的构建,对影响假病毒滴度的因素进行优化,确定了包装条件:利用转染试剂lipo3000,以膜蛋白表达质粒pCMV3.1-CHIKV与骨架质粒pSG3Δenv.cmv.Fluc 1:2的比例转染293T细胞,48h后收取上清。最终制备的CHIKV假病毒滴度可达1.0×107TCID50/mL。利用已构建的CHIKV假病毒在细胞水平建立中和活性检测方法并进行标准化研究。对假病毒敏感细胞、细胞和病毒加入量、检测时间等参数进行优化,确定其实验程序和参数为:将待测样品与400 TCID50的CHIKV假病毒于96孔板混合孵育1h后,加入50000/孔的293T细胞,48h后检测发光值并计算中和抗体滴度。该方法为疫苗、单抗、小分子化合物等抗病毒制品的筛选和评价提供了平台。基于CHIKV高滴度假病毒,首次建立了CHIKV假病毒可视化小鼠感染模型。以尾静脉途径（IV）感染4周龄的BALB/c小鼠,利用活体成像技术,动态观察病毒在小鼠体内的分布和代谢,并确定了CHIKV假病毒感染BALB/c小鼠的AID50为4.9×103TCID50。该模型的建立,使得在BSL-2环境下对CHIKV疫苗进行体内有效性评价成为可能。此外,本研究成功构建了针对CHIKV的DNA疫苗,采用已建立的体外中和抗体检测方法,对DNA疫苗免疫的豚鼠和小鼠血清进行了检测,发现该疫苗可诱导豚鼠及小鼠产生高滴度中和抗体,抗体滴度(ID50)可达1:8000以上。利用已建立的小鼠模型,对免疫血清进行了小鼠体内被动保护效果评价,结果表明该抗血清对CHIKV假病毒感染小鼠具有保护作用,且保护效果与抗体滴度相关（R2=0.66）。此外,本研究发现,提前给予小鼠GM-CSF刺激,并采用电穿孔技术辅助免疫,能使DNA疫苗诱导小鼠产生更高滴度的中和抗体（p<0.0005）,且抗体滴度与保护效果相关（R2=0.73）。将被动免疫与主动免疫的保护效果进行比较后发现,两者的保护效果无显著性差异（p=0.37）。此结果肯定了中和抗体在抗CHIKV假病毒感染中发挥的主要作用。总之,本研究成功构建了高滴度CHIKV假病毒,并于国内外首次建立了可视化的CHIKV假病毒小鼠感染模型。基于此建立了安全性好、灵敏度高的体内外中和活性评价方法。此检测平台可在BSL-2实验室操作,对于药物、疫苗、单抗等抗病毒制品的有效性评价提供了理想的检测方法。