三株拮抗菌对采后莲雾软腐病的生防效果与拮抗机理研究

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莲雾(Syzygium samarangense)是典型的热带水果,因外形美观,含有较高营养价值受到消费者青睐。但由于莲雾生长环境温度较高,空气湿度较大,采后极易受病原微生物的侵害导致腐烂。其中,软腐病是莲雾贮运过程中主要的侵染性病害。由于化学杀菌剂对食品安全带来的影响,绿色环保的保鲜技术是目前的发展趋势,生物防治成为果蔬采后保鲜研究的热点。本实验从莲雾病果上分离得到一株软腐病病原菌,以此病原菌为靶标从土壤中分离得到三株拮抗菌,研究了其对“大叶”莲雾软腐病的防治效果和对果实贮藏品质的影响,并对拮抗菌的抑菌机理进行了探讨,同时分析了果实中抗病相关酶活性,对苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆与表达。主要的研究结果如下:(1)从琼海莲雾种植基地选取具有典型软腐病病症的莲雾果实上分离得到一株软腐病病原菌,经形态学、致病性检验及分子测序鉴定为小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora);从琼海莲雾种植基地采取的根系土壤样品中共分离出143株菌,采用平板对峙法得到3株拮抗效果最佳的生防细菌G-1、HP-1和D-1,经形态学,生理生化实验及分子测序,分别鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)和沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis),3株拮抗细菌对小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)菌丝生长的抑制率分别为68.97%、58.00%和55.25%。(2)营养与空间竞争的研究:通过改变3株拮抗细菌与病原菌的接种时间,研究其空间竞争关系。结果表明:越早接种拮抗菌,则可提前占据有利空间,病斑直径越小,对莲雾软腐病的抑制效果越好。通过测定拮抗菌生长数量发现,拮抗菌与病原菌同孔接种时,病原菌的存在并未影响拮抗菌的生长,反而起到了促进作用,说明拮抗细菌提早消耗组织间营养物质,使病原菌生存条件受到抑制。(3)通过双平板滤纸法,发现3株拮抗细菌可产生大量非挥发性抑菌物质,在离体条件下抑制率分别达到87.50%、83.83%和75%;通过平板对扣法并结合气相色谱—质谱技术,发现拮抗细菌G-1能够产生少量挥发性抑菌物质,大多数为酮类、烷类、醇类、酸类和酯类。(4)体内实验研究了3株拮抗细菌对小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)的抑制效果。结果表明:通过果实接种实验,3株拮抗细菌均能有效控制莲雾软腐病,降低发病率;通过拮抗细菌菌悬液浸泡处理的莲雾果实,在常温条件下贮藏第10天,对病原菌的抑制率分别达到40.0%、45.5%和45.4%,显著高于对照组全部发病的情况;10~8CFU/m L的拮抗菌菌悬液浸泡莲雾果实能很好维持可溶性固形物、可滴定酸含量、总酚与类黄酮含量的水平,但失重率没有显著差异;3株拮抗细菌均可诱导莲雾果实中几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶等抗病相关酶活性显著上升,提高果实的抗病能力。(5)利用反转录PCR技术(RT-PCR),克隆得到了莲雾果实PAL基因的c DNA片段,分析结果表明:PAL1共有293个氨基酸,预测分子量为32.7 KD、等电点为9.58;PAL3共有240个氨基酸,预测分子量为26.6 KD、等电点为5.29;PAL1、PAL3基因核苷酸序列与其他植物PAL基因有很高同源性,且均属于PAL基因家族;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明PAL1和PAL3基因在莲雾果实整个贮藏过程中均有表达,总体均呈现先上升后下降的趋势,在贮藏第8天表达量达到最大值。
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