背景和目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱,是由遗传原因和环境因素作用而累及全身,需要长期治疗、困扰全球的慢性代谢性疾病,久病可引起患者多系统损害。糖尿病是WHO确定的4大主要非传染性疾病之一,全球每8秒钟就有1人死于糖尿病,每年死于糖尿病者约400万,据WHO数据资料统计,全球已有糖尿病患者1.8亿左右,预测到2025年全世界糖尿病患病人数将达3.33亿,2011中国最新糖尿病流行病学调查结果表明：在年龄≥20岁的中国人群中,糖尿病和糖尿病前期患病率分别高达9.7%和15.5%,以此推算目前中国有9240万成年人患有糖尿病,有1.482亿人处于糖尿病前期。我国糖尿病患病率快速上升的现实的确令人堪忧。糖尿病患者的免疫力低下,病人的血糖升高,皮肤组织的糖原含量也增高,这样就给霉菌、细菌的感染创造了良好的环境,很容易并发各种真菌、细菌和病毒感染,在糖尿病的各个时期,可出现多种皮肤病变,糖尿病患者罹患皮肤病的比例约占25%～30%。酮康唑(Ketoconazole)为化学合成吡咯类(azoles)抗真菌药,具广谱抗真菌作用,对念珠菌、着色真菌、球袍子菌、隐球菌、组织胞浆菌、皮炎芽生菌、孢子丝菌等均具抗菌活性。对全身真菌感染,深部真菌感染,表皮真菌感染均有效。酮康唑口服可引起多种毒副作用,如肝毒性、胃肠道反应等。所以目前的主要使用形式为外用制剂,包括酮康唑凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、混悬液洗剂等。微透析(Microdialysis)技术是一种先进的在体取样技术,其最大优点是可在基本不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体,实时和在线取样,该技术用来监测生物体局部药物浓度有着独特的优势。对于糖尿病皮肤外用酮康唑经皮给药制剂与正常皮肤的差异性,目前尚无科学系统的评价。因此,开展糖尿病患者经皮吸收的研究,对指导糖尿病患者合理地使用抗真菌药物,具有非常大的社会意义。并期望在研究结果的指导下提高用药安全,提高患者的生命质量,最终为社会带来经济效益。本研究利用微透析技术及体外扩散池(Franz)技术对临床常用的抗真菌药物酮康唑进行研究,将其制成凝胶剂、乳膏剂和软膏剂,比较其经糖尿病和正常大鼠皮肤的渗透吸收差异,并分析皮下组织药物浓度／血药浓度一时间曲线图,计算各种动力学参数。希望研究结果能为临床药师开展针对糖尿病病人合理外用酮康唑制剂咨询提供依据,为指导临床医师、护士防治及护理糖尿病患者时适宜地外用酮康唑制剂提供一定的实验参考依据。内容和结果为研究糖尿病皮肤的改变对药物经皮吸的影响,需要建立一种糖尿病动物模型,本课题采用操作简单且成功率较高的链脲菌素(STZ)腹腔注射法诱导建立大鼠糖尿病模型,分别采用大剂量单词注射和小剂量多次注射并配合高糖高脂饮食诱导,建立一型和二型糖尿病模型。造模给药后,发现造模组大鼠较正常组体重有明显下降,而血糖发生了显著升高(＞16.7mmo1),且能在较高水平能维持很长时间,说明造模方法成功可行。体外Franz扩散实验中,将80只Wistar雄性大鼠随机分成正常组及糖尿病模型组,每组40只,对造模组大鼠进行糖尿病造模。取大鼠腹部皮肤进行体外透皮扩散实验,考察酮康唑凝胶剂、乳膏剂、软膏剂经两组大鼠皮肤的差异性,每种剂型、每组各做六只大鼠。接收液均采用含10%乙醇的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4),HPLC法测定接收液中的药物量,并计算出药物渗透速率。HPLC检测采用C18柱,流动相甲醇-pH6.8磷酸盐缓冲液=70:30,紫外检测波长235nm,流速1.0mL·min-1,进样量20μL。结果发现,酮康唑凝胶剂经正常组、糖尿病模型组的渗透速率分别为3.38+0.36和4.56±0.67糖尿病模型组与正常组之间存在显著差异(p<0.05,n=6)；酮康唑乳膏剂经正常组、糖尿病模型组的渗透速率分别为1.33+0.41和1.87+0.11(μg·h-1·cm-2),糖尿病模型组与正常组之间存在显著差异(P<0.05,n=6)；酮康唑软膏剂经正常组、糖尿病模型组的渗透速率分别为0.77+0.42和1.72+0.86(μg·h-1·cm-2),糖尿病模型组与正常组之间存在显著差异(P<0.05,n=6)。由这些数据可知,与正常皮肤相比,患糖尿病后的皮肤能引起药物经皮透过性的增加,三种剂型得出一致结论,说明这种差异性与剂型关系不大,而与糖尿病后发生一定程度的皮肤组织学改变存在密切关系。在体微透析实验中,分别在大鼠的颈静脉和腹部皮下植入微透析探针,灌流液采用Ringer液,流速为1μL·min-1,每45min收集一份样品,样品采用LC-MS/MS方法进行检测。C18色谱柱,流动相为乙腈-0.1%甲酸水(70:30),流速0.3ml·min-1;进样量10μ1。质谱条件采用电喷雾二级质谱,ESI源,使用全扫描一级质谱和选择离子正离子检测,多级反应检测模式(MRM)。脱溶剂温度350℃,脱溶剂气流速11L.min-1、裂解电压205eV、碰撞能量25eV、酮康唑的扫描离子片段分别为531.2→82.1。在体微透析结果显示,三种剂型得出一致结果,即糖尿病大鼠腹部皮下Cmax及AUCall同正常组大鼠组相比具有显著性差异(P<0.05,n=6),Tmax没有显著差异(P>0.05,n=6),这说明糖尿病皮肤的改变真实地增加了药物的局部渗透吸收。但颈静脉Cmax、AUCal及Tmax两组间并不存在显著性差异(P>0.05,n=6),由于微透析法只能够测定血浆中游离药物浓度,说明正常组和造模组大鼠血液中游离药物浓度的差异并不是很大,但不能排除进入血液的大部分药物发生了代谢或与血浆蛋白的结合,以及药物进入体内后转运和代谢的复杂过程减弱了经皮透过量对血药浓度的影响。结论与讨论本研究中建立了成熟的糖尿病大鼠建立方法,及酮康唑的HPLC及LC-MS/MS检测方法,并完善了微透析的实验方法。采用体外Franz扩散池技术及体内微透析的方法对其进行了验证,综合体内外结果说明,糖尿病的发生确实会引起皮肤发生一定的病理改变,从而造成了酮康唑透过的增加,因此,提示糖尿病患者在使用KTZ等外用抗真菌药物给药时,可能需要要酌情考虑药物的使用剂量,从而减少药物的毒副作用,提高患者的生活质量。在课题研究中,由于时间、精力等原因,还有很多不足之处。例如,只考察了酮康唑这一种药物,药物经皮转运和吸收过程复杂,与分子结构,药物代谢机制密切相关,所以仅凭一种药物的研究结果并不能代表所有抗真菌药物,后续在时间和精力允许的情况下,考虑以现有实验方法为基础,进一步补充模型药物,做深入研究。在体微透析实验中动物个体差异很大,颈静脉药动学参数没能拿到很好的结果,后续研究中可考虑改进探针体内回收率的考察方法,或检测酮康唑代谢物等方法做深入考察。氢化可的松引起的皮肤组织学改变对其他药物经皮透过的影响实验只考察了体外部分,在时间允许的情况下可做在体实验,做深入考察。