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瓜叶菊(Senecio cruentus Masson ex L’Herit)是菊科千里光属广泛栽培的观赏植物,其花色变异丰富,具有白色、黄色、粉色、洋红色和蓝色等多个花色品种,是研究高等植物呈色的好材料,并能够为改良其近缘观赏作物菊花的花色提供基因资源。花青素是植物花器官的最主要的呈色物质,花青素代谢从柚皮素处开始产生3个常见的花青素合成分支途径,分别形成矢车菊素、天竺葵素和飞燕草素,进而决定花色呈现红色、桔红色和蓝色。因此,分支途径的形成是产生理想花色的基础。迄今对花青素分支途径形成的调控机理仍不清楚,限制了花色改良的分子育种。前期的研究结果表明,瓜叶菊同时拥有3个花青素苷合成分支途径,是研究花青素苷合成分支途径调控机制的良好材料。本研究拟通过对瓜叶菊花青素合成不同分支之间的竞争机制和花青素苷合成分支途径的调控机制进行研究,为人工调控花青素苷合成分支途径,继而进行花色改良,特别是蓝色花的分子育种提供宝贵的基因资源和分子设计策略,同时在理论上为高等植物花青素代谢的分支调控机理提供新的知识。本研究获得了以下主要结果：(1)利用HPLC-MS/MS技术对瓜叶菊蓝色、洋红色、粉色、白色和黄色5个花色品种舌状花中的类黄酮合成途径各中间产物的成分和含量进行测定发现,在白色和黄品种中,柚皮素和二氢山奈酚(dihydrokaempferol, DHK)占所测总类黄酮物质的90%以上,其花青素合成途径在此处被阻断,而不积累花青素；蓝色、洋红色和粉色瓜叶菊分别积累不同种类的花青素：在蓝色系中,飞燕草素和矢车菊素分别占67%和11%,主要积累飞燕草素,而呈现蓝色；在洋红色系中,矢车菊素和飞燕草素分别占92%和1%,主要积累矢车菊素,而呈现洋红色；而在粉色系中,中间产物DHK大量积累,仅有少部分(26%)流向下游被合成为天竺葵素,而呈现粉色。(2)通过对瓜叶菊蓝色、洋红色、粉色、白色和黄色5个花色品种中花青素苷合成途径各结构基因的表达模式进行分析,结合前一章中对瓜叶菊5个花色品种花青素苷代谢流中各中间产物成分和含量的测定结果,发现F3H, DFR和ANS基因是决定瓜叶菊是否能够合成花青素的关键基因,在白色系和黄色中,三者的不表达使其不能积累花青素。而F3’H和F3’5’H是决定瓜叶菊花青素苷分支形成的关键基因,F3‘H和F3’5’H对底物DHK的竞争,决定了粉色、洋红色和蓝色花的形成：在蓝色系中,ScF3’5’H高丰度表达,ScFS’H1低丰度表达,以合成飞燕草素为主；在洋红色系中,ScF3’H1高丰度表达而ScF3’5’H不表达,以合成矢车菊素为主；在粉色系中,ScF3’H1和ScF3’5’H均低丰度表达,DHK直接在ScDFR3的催化下合成天竺葵素,而呈现粉色。而未发现4个DFR基因在粉色、洋红色和蓝色间的表达差异,结合生物信息学分析,证明在瓜叶菊中花青素分支形成与DFR的底物特异性没有相关性。(3)本章对调控瓜叶菊花青素苷合成的MYB、bHLH,以及WD40转录因子进行了分离,在此基础上分析了上述花青素相关转录因子在瓜叶菊不同花色品种间的表达模式,发现ScbHLH17、ScbHLH21和ScbHLH22的表达模式同ScDFR3、ScANS的表达模式一致,表明瓜叶菊花青素相关转录因子主要通过决定瓜叶菊合成关键基因ScDFR3、ScANS的表达模式,继而决定能否形成花青素。但并未发现与瓜叶菊花青素分支关键基因ScF3’H和ScF3’5’H表达模式相符的转录因子,表明花青素相关转录因子主要决定瓜叶菊能否积累花青素,而不能决定瓜叶菊不同分支途径的形成。(4)通过对瓜叶菊花青素代谢分支关键基因ScF3’5’H的序列进行分析,发现ScF3’5’H不表达的洋红色、粉色和白色系DNA序列相似,而ScF3’5’H表达的蓝色和黄色系DNA序列相似,差异主要集中在第一内含子区,前者第一内含子区有一段首尾重复序列的插入,可能对ScF3’5’H的表达起调控作用。同时还发现ScF3’5’H表达与否与其启动子中是否含有招募花青素相关转录因子的ACE和MRE元件密切相关,ScF3’5’H基因不表达的洋红色、粉色和白色系瓜叶菊启动子区不具有ACE和MRE元件,导致ScF3’5’H基因的不表达。综上研究结果,得出了本研究的主要结论：F3‘H和FY5’H对底物DHK的竞争,决定瓜叶菊形成何种花青素苷合成分支途径,继而决定了瓜叶菊粉色、洋红色和蓝色花的形成：ScF3’5’H的高表达和ScF3’H1的低表达使蓝色瓜叶菊主要积累飞燕草素；ScF3’5’H的不表达和ScF3’H1的高表达使洋红色瓜叶菊主要积累矢车菊素；ScF3’5’H和ScF3’Hl的不表达使粉色瓜叶菊主要积累天竺葵素。F3H, DFR和ANS的表达量决定瓜叶菊能否合成花青素苷：ScF3H1、ScDFR3和ScANS的低表达,使白色和黄色瓜叶菊不能积累花青素。bHLH转录因子在调控瓜叶菊能否合成花青素苷上起着重要的作用：瓜叶菊花青素苷相关转录因子ScbHLH17、ScbHLH21和ScbHLH22能够通过调控ScDFR3和ScANs的表达模式,从而决定瓜叶菊能否积累花青素苷。关键分支点基因F3’5;H自身的启动子顺式作用元件及内含子序列在调控瓜叶菊花青素苷分支途径的形成上起着重要的作用：ScF3’5’H启动子区关键顺式作用元件(如MRE、ACE)的有无及其内含子区的序列,决定ScF3’5’H基因在瓜叶菊不同花色品种间的表达模式,继而使瓜叶菊形成不同的花青素苷分支途径。本研究为植物花色改良的分子育种提供依据,为解析花青素合成分支调控的理论研究提供参考。