1700nm波段多光子显微镜用光学元件及浸润介质透过性能表征及成像应用

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1700nm波段已经被证实是深层组织多光子成像最具潜力的激发波段。高激发波长以及信号波长透过率的多光子成像系统对多光子成像技术尤为重要,可以直接提高成像深度以及成像速度。然而,目前该波段多种多光子显微镜用光学元件及浸润介质透过性能未知,严重妨碍了成像系统的优化。为了优化多光子显微镜透过率性能,我们在1700nm波段测量了大量多光子显微镜用光学元件(长波通滤光片,双色片,物镜)的透过率及常用物镜用浸润介质(水、重水(D2O)和多种浸润油)的吸收谱,并展示了其在多光子成像信号提升中的应用。具体工作包括:(1)精准测量了一些长波通滤光片和双色片的透过率,根据测量结果选择长波通滤光片和双色片,使得系统激发光透过率提高了50%以上。(2)开发了一种测量高数值孔径物镜宽带透过率的方法。量化对比适用于深层多光子成像的两种水浸物镜透过率,其中一种普通镀膜,另一种为了提高1700nm波段透过率进行特殊镀膜。依据测量结果实现生物样品中的四次谐波产生成像以及碳量子点的五光子荧光成像。通过深层脑成像对比进一步明确了何种物镜更适合最深层三光子荧光信号产生,由此获得了活体小鼠脑内超过1600?m深的成像深度。这些结果将为1700nm波段多光子成像物镜的选取提供指导。(3)在浸润介质方面,我们精确测量了重水1700nm波段吸收谱并演示了其应用,结果显示在1662nm激发时,重水浸润的二次谐波成像、三光子荧光成像和三次谐波成像信号分别是水浸润的8.1、24.8和24.7倍,这跟基于我们测量的吸收谱数据计算的理论值相吻合,证实了重水是深层组织成像的良好浸润介质。(4)为了提高1700nm波段深层组织油浸多光子成像信号强度,我们测量了几种常用浸润油的吸收谱,并提出了混合不同浸润介质以获得折射率可调谐、低吸收新介质的建议。基于浸润油吸收谱数据,我们给出了1700nm波段油浸成像时的最佳激发波长,并通过小鼠组织的二次谐波成像和三次谐波成像证实了我们的选择:相比于1700nm激发,1600nm激发能够使得多光子信号水平数量级提升,可以清楚地观察到小鼠皮肤表层下200?m深的结构,而1700nm激发的几乎看不到结构。最后,我们总结了实验结果并对多光子未来的发展提出了些展望。
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