研究背景:膀胱癌是世界上第十大恶性肿瘤,其每年新发病例数占新发肿瘤病例总数的3%,并且每年约有21万人会因膀胱癌丧命。由于膀胱癌具有易复发及进展的特点,膀胱癌的早期诊断、早期治疗以及治疗期间的定期监测具有重要的临床意义。尽管膀胱癌传统诊疗手段能使大部分患者临床受益,但诊疗过程中有可能会导致正常组织的损伤,因而探索膀胱癌的精准诊疗方式一直是研究的热点。研究表明,75%非肌层浸润性膀胱癌可以发生成纤维生长因子受体3过表达,导致非配体依赖性二聚体的产生及下游信号通路的激活,最终导致膀胱癌的发生。正因如此,大量研究开始开发成纤维生长因子受体抑制剂用于膀胱癌的靶向治疗,其中厄达替尼是第一个被美国食品药品监督管理局批准用于进展性或转移性膀胱癌治疗的成纤维生长因子受体抑制剂。尽管厄达替尼已被证实对膀胱癌具有良好的治疗效果,但是高频次的给药及多种副作用的发生明显限制了厄达替尼的临床应用。因此开发一种更安全有效的药物平台用于递送厄达替尼具有重要的临床意义。纳米药物在药物负载及其功能化方面表现出独有的优势,通过合理设计可以有效负载难溶性药物并赋予纳米药物新的功能,包括延长的体内半衰期、降低的药物毒性及成像功能等。然而基于有机或无机材料制备的纳米药物的临床应用仍受制于其较强的细胞毒性及较差的生物相容性。另外,复杂的制备方法及不均一的药物尺寸进一步阻碍了该类药物的放大生产。因此,利用具有良好生物相容性及低细胞毒性的材料制备多功能纳米药物对于拓展纳米药物临床应用及增加临床受益人群有着重要意义。类弹性蛋白是一种基于弹性蛋白疏水区域设计得到的人工多肽,其不仅具有聚合物负载药物体系的优势,还表现出一系列聚合物难以实现的特性。首先,类弹性蛋白具有良好的生物相容性及可降解性,在体内可被降解为无毒的氨基酸。另外,可以通过基因工程手段设计获得具有特定功能的类弹性蛋白或者融合蛋白。不仅如此,类弹性蛋白因其有较低的相转换温度而表现出温度响应性,基于该特性类弹性蛋白的纯化过程也被明显简化。正因如此,类弹性蛋白被广泛应用于药物负载领域。基于本课题组前期的研究,以重组类弹性蛋白构建的纳米载体具有高载药量、低毒、长效及良好生物相容性等特点。另外,自主构建的近红外荧光蛋白-类弹性蛋白融合蛋白不仅具有类弹性蛋白的优势,更展现出高分辨的深层组织成像能力,因而是开发兼具成像功能的药物递送平台的不二之选。研究目的:制备并表征具有良好生物相容性的多功能纳米药物,探究该纳米药物的药代动力学参数、体内外膀胱肿瘤杀伤作用、毒副作用、细胞内分布情况以及成像功能。研究方法:1.通过基因工程的手段制备mIFP-K72重组蛋白,然后以m IFP-K72重组蛋白、羧酸化聚乙二醇以及厄达替尼为原材料通过自组装的方式制备多功能纳米药物,利用透射电镜与粒度分布仪分别对纳米药物及纳米载体的尺寸及形貌进行表征。2.利用细胞增殖实验以及活死细胞染色评价纳米药物、载体及厄达替尼在体外的肿瘤细胞杀伤作用,并比较各种药物的半数抑制浓度。通过尾静脉给小鼠注射纳米药物并收集不同时间点的小鼠血浆,利用高效液相色谱仪检测各时间点血浆中药物含量,进一步计算药物体内半衰期及生物利用度。利用共聚焦显微镜观察纳米药物及厄达替尼在细胞内的分布情况并分析纳米药物在细胞内的作用机制。3.制备异种皮下膀胱肿瘤模型并记录治疗期间模型的肿瘤生长情况,进而比较不同药物的肿瘤生长抑制作用及其毒副作用。然后进一步对各组离体肿瘤组织进行组织学分析并评估各组细胞增殖相关抗原表达情况。另外,利用动物成像仪评估纳米药物在肿瘤模型中的的实时成像功能。研究结果:1.通过自组装策略制备出尺寸均一的纳米药物,其中纳米药物及载体的平均直径分别为（161.8±45.6）nm及（120.8±36.1）nm。具有中空结构的球状纳米载体能有效负载厄达替尼,载药率及负载率分别达33.6%和43.7%。2.厄达替尼对具有FGFR3高表达的RT4细胞的肿瘤生长抑制作用明显强于对FGFR3低表达的T24细胞的肿瘤生长抑制作用,进而证实了厄达替尼对FGFR表达具有选择性的抑制作用。另外,在两种细胞中纳米药物的抗肿瘤作用均优于单纯厄达替尼,而纳米载体对两种细胞均未表现出细胞毒性作用。当作用于RT4细胞时,纳米药物及厄达替尼的IC50值分别为14.0 nmol/L和29.9 nmol/L,而当作用于T24细胞时,两组IC50值分别为25.5μmol/L和35.4μmol/L。活死细胞染色实验得到了类似的结果,即纳米载体组出现少量死细胞,而厄达替尼组及纳米药物组出现大量死细胞。3.通过研究纳米药物在体内的代谢情况发现纳米药物的有效半衰期和生物利用度分别提升至14.4 h和8.0μg/m L·h,而这分别是单纯厄达替尼药物相应指标的8.3倍和5.0倍。另外,细胞内药物分布研究表明,厄达替尼及纳米药物进入细胞后主要被转运到溶酶体内。4.高、中、低剂量纳米药物治疗组与厄达替尼治疗组表现出明显的体内肿瘤生长抑制作用,高、中、低剂量纳米药物组及厄达替尼组的平均肿瘤体积分别是（52.8±9.3）mm~3、（52.7±15.6）mm~3、（70.6±13.0）mm~3和（48.8±3.4）mm~3,四组的肿瘤生长抑制率分别为69.1%、69.1%、58.6%和71.4%。而载体组与PBS组中平均肿瘤体积分别增长到（160.5±6.7）mm~3和（170.7±14.4）mm~3。5.HE染色及免疫组化染色的结果进一步验证了纳米药物具有显著肿瘤生长抑制作用。在HE染色结果中,治疗组可以看到比对照组更低比例的肿瘤细胞且且出现散在钙化灶,而在对照组中则能见到肿瘤细胞细胞核异型性明显且核质比高。另外,药物治疗组的Ki67表达量显著低于对照组,定量后发现高剂量组、中剂量组与厄达替尼组的Ki67表达量均低于其他三组且有显著性差异,低剂量纳米药物治疗组的Ki67表达量低于PBS组与载体组且有显著性差异。然而厄达替尼组在治疗后表现出显著高于其余各组的血磷含量,平均浓度达（3.8±0.3）mmol/L。6.纳米药物展现出高分辨的靶向成像能力。注射纳米药物16 h后,纳米药物组在肿瘤局部发现了明显的荧光信号,而PBS组未发现荧光信号。研究结论:1.本研究提出一种通用的纳米药物组装策略,基于该策略制备的多功能纳米药物实现了厄达替尼的高效负载、靶向递送及缓慢释放。2.多功能纳米药物有效延长了厄达替尼的体内作用时间并缓解了因厄达替尼治疗导致的毒副作用,进而实现了长效、强效且安全的膀胱肿瘤治疗作用。3.多功能纳米药物展现出高分辨的成像能力,从而实现了膀胱肿瘤治疗成像一体化。