研究背景：霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio Cholerae, VC)引起的以急性水样便为主要特征的肠道传染病。在已发现的200多个霍乱弧菌血清群中,只有01群和0139群能够引起霍乱的暴发和流行。自1817年以来,霍乱已经引起了七次世界范围的大流行,目前仍是我国一类防控的肠道传染病。广东省地处我国东南沿海地区,与加尔各答、印度和孟加拉湾同处相同的纬度,是我国霍乱的流行高发地区。1961年7月,广东省阳江县报告了我国建国以来首起埃尔托霍乱疫情以来,开启了我国霍乱第七次大流行的序幕,至2013年止,我省霍乱累计发病近80000例,死亡近2000人,严重影响和危害了人民健康,影响了生产、旅游、外贸、交通运输,甚至社会安定。霍乱肠毒素CT是霍乱弧菌最重要的致病因子,其编码基因为ctxAB,是目前已知的致泄毒素中最强烈的毒素。携带ctxAB基因的霍乱弧菌称为产毒株,是引起霍乱暴发流行的主要病原体,而不携带ctxAB基因的霍乱弧菌非产毒株对人不致病或偶然有些菌株引起腹泻,一般不引起霍乱的暴发和流行。研究发现,01群和0139群霍乱弧菌产毒株的基因组相对比较保守,第七次霍乱世界大流行期间分离的01群埃尔托型霍乱弧菌产毒株的基因组仅存在细微的变化,这些变化随时间的推移慢慢地累积,而01群和0139群非产毒株的基因组则表现出明显的遗传多样性。这些研究基础将为我们进一步使用更高分辨率的分子分型方法去研究霍乱弧菌产毒株的进化和变异特征提供基础。细菌分型是推断菌株间关系的常用方法,可用于重新构建种系进化关系、描述菌群结构,也可以用于传染病暴发的溯源分析。细菌分型早期主要依靠形态学方法,如血清分型、噬菌体分型、毒素分型及抗生素耐药谱等。近年来,基于DNA序列分析的分子分型成为主要的技术。其中,脉冲场凝胶电泳技术(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)是当前细菌分子分型的主流技术,通过限制性内切酶消化细菌基因组后产生的DNA指纹图谱进行暴发识别和溯源分析。此外,多位点序列分型(Multilocus sequence typing. MLST)和多位点可变数目串联重复序列分析(Multilocus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)等分子分型方法,通过互联网数据库大大简化和方便了不同实验室间的数据交流与共享,有利于快速进行大范围的暴发调查和溯源分析。但是,这些分型方法仅反映了病原菌基因组的局部遗传信息,分辨力有限,对于高度克隆化的菌株,或进行大时间跨度的流行病学研究稍显不足。全基因组测序(Whole-genome sequencing,WGS)分型,可在全基因组碱基序列的基础上进行流行病学分析,全面反映了病原菌的遗传与变异特征,大大提高了菌株进化和溯源分析的分辨力,有助于快速地确认并追踪到病原体。上个世纪90年代开始,广东省在霍乱防治中逐渐建立了核糖体分型、脉冲场凝胶电泳技术以及荧光聚合酶链反应等分子生物学监测技术,主要用于探索在发生霍乱暴发疫情时,对病原体进行快速鉴定和溯源分析。目前,尚未有研究对我省历年霍乱弧菌的病原学分子特征进行全面的梳理,尤其是在全基因组的层面上对我省霍乱弧菌的基因多态性和遗传发生关系进行系统的分析。随着新一代测序技术的成熟,WGS分型所需时间不断缩短,成本不断降低,全基因组测序分型不仅能够全面反映基因组进化特点,对于研究病原菌的遗传与变异以及对传染源的溯源分析均具有重要价值和明显优势。本研究选取广东省1961-2013年50多年间从霍乱病例分离的381株01群(稻叶型148株,小川型233株)和136株0139群霍乱弧菌代表性菌株进行血清分型、毒力基因PCR检测、ctxB和tcpA基因扩增产物测序分型和PFGE分子分型,以全面了解和掌握我省霍乱弧菌基本的菌型分布和分子特征,然后根据PFGE指纹图谱、ctxB和tcpA基因分型结果,选择154株代表性的菌株进行全基因组测序分型。将这154株代表菌株的全基因组序列与另外126株国内其它省份代表株和107株国际代表株的全基因组序列进行基于全基因组的单核苷酸多态性鉴定(wg-SNPs)和构建最大似然树,以此深入分析我省霍乱弧菌基因变异情况,并结合流行病学资料,构建我省霍乱弧菌种系发生关系,推断病原体的进化过程,从分子遗传的角度阐明我省不同时期霍乱的流行特点,从分子机制上深入理解我省霍乱弧菌菌株变迁进化和变异规律,为今后霍乱弧菌分子流行病学监测、暴发识别和精确溯源分析提供研究基础。研究目的：1.系统地了解和掌握1961年广东省首次暴发O1群埃尔托型霍乱,至2013年期间,我省O1群和O139群霍乱弧菌病例分离株的血清型别转换分布规律、主要毒力基因携带和PFGE分子分型特征；2.在全基因组的水平上,分析我省O1群和O139群霍乱弧菌遗传进化和变异特征,构建我省霍乱弧菌种系发生关系,摸清我省不同流行阶段霍乱弧菌的传染来源和流行路线等分子流行特征。为构建广东省霍乱弧菌分子溯源数据库,建立基于wg-SNPs的高分辨力的霍乱弧菌分子流行病学监测、暴发识别和溯源分析体系提供依据。研究内容与方法：1.文献调查研究：通过文献调研的方式查阅1961年以来广东省霍乱流行史料,并根据霍乱监测资料和流行特征,将1961年以来广东省霍乱流行分为4个时期,根据不同流行时期,不同地区,症状的轻重以及不同的血清亚型选取代表性病例菌株517株,其中O1群霍乱弧菌381株(小川型233株,稻叶型148株),O139群霍乱弧菌136株。2.菌株复苏和复核鉴定：用普通营养肉汤对冻干菌株进行复苏,并用普通API生化鉴定和血清分型对菌株进行再鉴定、以核实菌株的型别。3.菌株毒力基因检测：采用QIAgen DNA minikit试剂盒进行菌株核酸提取,并采用普通PCR的方法对菌株的ctxB, ace, zot, tcpA, tcpl, hlyA, ompU, rtxC和st等常见霍乱毒力基因进行PCR定性检测,对ctxB和tcpA基因阳性PCR产物进行测序分型。4. PFGE分子分型：对代表性菌株进行NotI限制性内切酶消化后进行PFGE分子分型。利用BioNumericsV6.6软件(Applied Maths BVBA)分析PFGE指纹图谱,得到菌株带型相似性的聚类分析树图(UPGMA)。5.全基因组测序分型分析：根据上述实验结果,选取代表性菌株154株进行全基因组测序分型,以标准参考菌株N16961的全基因组序列为参照序列进行de novo方式拼接和组装,使用MuMMER进行全基因组的SNPs (wg-SNPs)鉴定和分析,分析我省霍乱弧菌基因变异情况,并结合流行病学资料,根据非重组位点以MEGA6.0构建最大似然树,分析我省霍乱弧菌种系发生关系。研究结果：1.流行分布特征：1961年首次暴发01群埃尔托型霍乱,至2013年期间,广东霍乱流行可分成4个流行期,每一个流行期都与一个优势菌型相关,且具有相对独特的流行病学特征。其中,第一次流行期(1961-1969年)的优势菌型是01群小川型；第二次流行期(1978-1989年)优势菌型为01群稻叶型；第三次流行期(1990-1999年)优势菌型为01群小川型；第四次流行性(2000-2013年)以小型暴发和散发为主,优势菌型为01群稻叶型。而1993年出现的0139群霍乱弧菌,至今近20年间,主要以散发和小型暴发为主,从未引起大规模的暴发流行。2.毒力基因携带情况：1)381株01群埃尔托霍乱弧菌中,有367株同时携带了ctxB, ace和zot基因,374株携带了tcpA基因,其余14株为ctxB, ace和zot基因阴性。PCR产物测序分析发现,1992年以及之前分离到的160株为埃尔托型ctxB,1993年及以后分离的207株中,除1株为埃尔托型ctxB外,其余的均为古典型ctxB,而所有tcpA基因均为埃尔托基因型。2)136株0139群霍乱弧菌中,有123株同时携带了ctxB, ace和zot基因,123株携带了tcpA基因,其余10株为ctxB, ace和zot基因阴性。PCR产物测序分析发现,113株为ctxB基因3型(埃尔托型),7株为ctxB基因1型(古典型),3株为ctxB基因5型,而所有tcpA基因均为埃尔托型。3. PFGE分子分型：1)381株01群埃尔托霍乱弧菌经过Not I限制性内切酶消化后,可分成113个不同的PFGE指纹图谱,并进一步分析形成5个cluster,不同流行时期的菌株分别对应形成不同的cluster,如cluster I (第一次流行期),Ⅱ(第三次流行期),Ⅲ(第二次流行期)和Ⅳ(第四次流行期)。cluster V中包含了四个不同流行时期的菌株,菌株之间指纹图谱的相似度较低,显示出明显的异质性,可进一步划分出10个以上不同的谱系。优势菌型为小川型的cluster I和Ⅱ之间的相似度为80.3%,优势菌型为稻叶型的cluster III和Ⅳ之间的相似度为81.6%。2)136株0139群霍乱弧菌经过Not I限制性内切酶消化后,可分成75个不同的PFGE指纹图谱,进一步分析可形成2个cluster:cluster A和cluster Bo其中,cluster A主要包含了7株1998-2000年间分离的非产肠毒素0139群霍乱弧菌,这7株非产肠毒素菌株的PFGE指纹图谱均不相同。cluster B中主要包含了所有的产肠毒素0139群霍乱弧菌以及其它的非产肠毒素菌株(分离自1998和2007年),cluster B中68个PFGE指纹图谱的相似度为82.4%。4.全基因组测序分析：1)387个全基因组经过MuMMER鉴定和分析,我们共鉴定出来10396个SNPsc其中,3351个SNPs位点是特定于外群菌株M66(1961年第七次霍乱大流行之前分离的菌株),其余的5534个SNPs可用于区别来自1961年以来的第七次大流行的387个基因组。2)我省分离的O1群埃尔托霍乱弧菌菌株中重组现象非常少见,只有1511个SNPs由重组导致,主要发生在O抗原合成基因簇以及霍乱第七次大流行基因岛II (Vibrio Seventh Pandemic Island)中,其它SNPs均由突变事件导致。3)我省在第一次流行期初期分离的O1群埃尔托霍乱弧菌与霍乱第七次世界大流行初期印度尼西亚的菌株遗传距离很近,比国内其它省份在同期分离的菌株更接近最大似然树的根部。在第二次流行阶段早期分离的01群埃尔托霍乱弧菌,有部分代表株独自成簇,比国内其它省份同期分离的菌株更靠近进化发生树的根部。4)在遗传进化树上,广东省分离的O1群霍乱弧菌在至少在两个分支中处于根部,是同期南亚分离株的最近共同始祖(Most Recently Common Ancestor, MRCA),紧随这些南亚菌株之后,又是从中国多个省份(包括广东省)分离到的O1群霍乱弧菌。5)在O139群霍乱弧菌的遗传分支中,1993年广东省分离的最早两株0139群霍乱弧菌处于该遗传分支的最靠近根部的进化分支,并且其与O1群埃尔托型霍乱弧菌菌株的遗传距离最近。1998年之前分离的O139群霍乱弧菌中,广东省分离的霍乱弧菌在遗传分支上均处于相对根部的位置。而1998年之后分离的霍乱弧菌中,广东省分离的霍乱弧菌很少处于相对根部的位置。研究结论：1.1961-2013年,广东省霍乱流行具有阶段性的特征,根据每一阶段的流行病学特征和病原学特征,可大致分成四个流行期,每一个流行期都与一个优势菌型相关：第一次流行期为小川型(1961-1964年),第二次流行期为稻叶型(1978-1989年),第三次流行期又是小川型(1990-1999年),第四次流行期主要是稻叶型(2000-2013年),这种优势菌型的变换与我国其他地方以及周边亚洲国家的变化态势类似。2.1992年之前的分离O1群霍乱弧菌均携带埃尔托型ctxB等位基因ctxBEITor,而1992年之后的分离的O1群霍乱弧菌均携带古典型ctxB等位基因ctxB这个等位基因的变化与我国其他的地方,以及亚洲、非洲和拉丁美洲霍乱弧菌的变化一致。3.O139群分离株基本上都是ctxB基因3型,即埃尔托型。在本研究中,我们首次发现在O139群霍乱弧菌发现ctxB基因1型(古典型)和基因5型,这表明,ctxB基因的变异不仅仅发生在O1群霍乱弧菌上,O139群霍乱弧菌同样可能出现这种非埃尔托型的变异。4.381株O1群霍乱弧菌PFGE指纹图谱可聚类成5个cluster,高度相关的菌株均来自同一个流行期,提示每一次大流行期的开始,均是由一个新的变异株的引入。5.PFGE指纹图谱分析发现,O139群霍乱弧菌产毒株维持着相对紧密的克隆群,从不同地区分离到的菌株之间的遗传关系相近,而非产霍乱肠毒素的O139群霍乱弧菌则表现出丰富的多样性和多克隆谱系。6.全基因组单核苷酸多态性分析显示,我省病例分离的O1/O139群霍乱弧菌产毒株在遗传学上显示出高度单态性,菌株之间的差异绝大多数是由突变所导致。7.在01群霍乱弧菌的某些进化分支上,我省分离的菌株出现单独聚集成簇的现象,体现出一定的地域聚集性,该现象可能因这些菌株的传播能力较弱,没有引起广泛的传播和流行。8.霍乱传播模式的改变与菌株的遗传进化特征密切相关,在O139流行的初期,其传播特点类似于O1群埃尔托型菌株。1998年之后,O139的流行特点更类似于食源性传播的模式。9.我省O1/O139群霍乱分离株在国内和国际代表株中的特殊遗传进化特征,与我省所处特殊的地理位置,与南亚频繁的贸易交流中输入性病例有关。