研究背景甲状腺癌是头颈外科常见的恶性肿瘤,近三十年来的统计显示,甲状腺癌的发病率在世界范围内成逐渐上升的趋势。对于甲状腺癌治疗,国内外的诊疗指南均以手术为主,术后辅助以放疗及甲状腺激素内分泌治疗。分化型甲状腺癌(DTC)的恶性程度低,预后较好,但部分分化程度较低的甲状腺癌也表现出肿瘤生长较快,淋巴转移发生率高,对放化疗不敏感,术后复发转移等恶性特征。因此,探索肿瘤发病的分子机制,开发新型高效的治疗手段是甲状腺恶性肿瘤研究的重要课题。从天然植物中获取治疗疾病的小分子化合物,一直是抗肿瘤药物研发的重要途径。芒果苷是一种天然的类黄酮类化合物,在高等植物中广泛存在。芒果苷的药理作用广泛,大量实验证实芒果苷具有抑制中枢神经系统、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用。芒果苷还通过对多种分子靶点、信号通路的干预和调控,体现出其明显的抗致癌效果和潜在价值。根据既往的报导,芒果苷在体内和体外的药理研究中显示其对包括脑、宫颈、前列腺、肺、乳腺在内的多种恶性肿瘤具有明显的抗肿瘤效果。通过查阅相关文献,我们发现目前尚未有芒果苷应用于甲状腺癌治疗的相关报导,而且芒果苷确切的抗致癌作用机制尚不清楚。本课题以人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞为研究对象,在细胞生物学行为的实验研究中,我们发现芒果苷具有促进细胞凋亡,抑制细胞增殖、迁移的作用。为了分析芒果苷抗肿瘤作用的分子机制,我们依托网络药理学研究平台,使用反向筛选方法对芒果苷药理作用的潜在分子靶点进行了初步预测,并通过蛋白质互作分析、通路富集和正向分子对接工具对相关靶点进一步优化确认。在后续实验中,我们选择了具有较高研究价值的分子靶点和信号通路进行了初步验证,阐述了芒果苷诱导甲状腺乳头状癌细胞凋亡的分子作用机制。第一部分 芒果苷对甲状腺乳头状癌细胞的抗肿瘤活性研究研究目的使用芒果苷处理对甲状腺癌TPC-1细胞生长进行干预。通过对细胞的形态学观察以及分子生物学检测方式,验证芒果苷促进甲状腺癌TPC-1细胞凋亡,抑制细胞增殖、迁移的作用。研究方法1.人甲状腺乳头状癌细胞株体外培养。2.采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT assay)检测芒果苷对人甲状腺乳头状癌TPC-1及BCPAP细胞增殖的影响。3.采用Transwell小室迁移检测,观察芒果苷干预后TPC-1细胞迁移功能的改变。4.将细胞核做DAPI染色,观察芒果苷处理后TPC-1细胞核形态的改变,从细胞形态学角度评估芒果苷对细胞凋亡情况的影响。5.DNA片段分析(DNA fragmentation)检测芒果苷处理诱导TPC-1细胞DNA片段形成的作用,评估凋亡处理后细胞DNA的特征性变化。6.使用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色,观察芒果苷处理后TPC-1细胞的存活状态,评估芒果苷诱导凋亡的细胞在不同阶段的变化。7.蛋白质印迹法(Western blot)检测芒果苷处理后TPC-1细胞内凋亡环节相关蛋白(Bid,Bax,Bad,Bcl-2,cytochrome C,caspase-3,caspase-9)的表达水平,分析芒果苷的干预对凋亡信号通路的影响。8.使用免疫荧光法联合DAPI复染色,观察增殖细胞核抗原(PCNA)在芒果苷处理后TPC-1细胞内的表达,评估芒果苷抑制TPC-1细胞增殖的作用。结果1.芒果苷的处理显著抑制了两种细胞的增殖,抑制作用呈剂量依赖性,即使低浓度的芒果苷也显示了抑制细胞生长的作用。芒果苷对两种细胞的半数抑制浓度分别为3.69μM(TPC-1细胞)和9.90μM(BCPAP细胞),TPC-I细胞对芒果苷的处理更为敏感。2.Transwell小室迁移检测显示,不同浓度梯度芒果苷处理后,TPC-1细胞的迁移功能受到了不同程度的抑制,4μM的处理浓度对细胞迁移功能的抑制更为明显。3.DAPI核染色显示在不同浓度梯度芒果苷处理后,TPC-1细胞核的形态发生了不同程度的变化,其中,4μM的处理使细胞核发生了典型的细胞核裂解的凋亡改变。同时可以观察到在4μM处理时细胞核数明显较对照组少。4.DNA片段的电泳结果显示,TPC-I细胞在不同浓度的芒果苷处理后均出现了特征性的DNA梯度的形成,而对照组细胞则显示完整的DNA条带。5.AO/EB染色显示实验组和对照组的TPC-1细胞均有细胞死亡的发生。但不同于坏死细胞的染色,在芒果苷处理组,凋亡TPC-1细胞的染色呈现明亮的红色或橙色。6.Western blot结果显示,芒果苷的处理增加了 TPC-I细胞内促凋亡蛋白Bid、Bad和Bax的表达水平而降低了抗凋亡蛋白Bc1-2的表达水平。同时,芒果苷的处理显著增加了细胞色素C、caspase-9和caspase-3的表达水平。7.免疫荧光法联合DAPI复染色观察到芒果苷的处理在诱导细胞凋亡的同时降低了增殖细胞核抗原(PCNA)在细胞内的表达。结论芒果苷的干预抑制了 TPC-1细胞的增殖和迁移功能。通过对TPC-I细胞的形态学观察分析,芒果苷的处理可以诱导TPC-1细胞发生凋亡。凋亡信号通路的分子生物学检测显示芒果苷的处理同时触发了外源性和内源性的凋亡通路。此外,芒果苷还通过抑制PCNA降低TPC-1细胞的增殖水平。实验结果验证了芒果苷对甲状腺癌细胞的具有诱导细胞凋亡,抑制增殖和迁移的作用,提示了芒果苷的抗致癌潜力。第二部分 基于分子对接的芒果苷抗肿瘤作用靶点筛选研究目的使用反向筛选方法对芒果苷药理作用的潜在分子靶点进行了初步预测,并通过蛋白质互作分析、通路富集和正向分子对接工具对相关靶点进一步优化确认。进一步阐明芒果苷抗肿瘤作用的分子机制,同时为以芒果苷为先导化合物的药物研发提供参考。研究方法1.使用药效团筛选在线服务器PharmMapper对芒果苷药理作用的潜在靶点进行初步预测,根据匹配度(Fit score)的分值由高到低进行排序。2.将芒果苷潜在作用靶点信息输入蛋白质互做网络(PPI)在线分析数据库String分析各药物靶点相互作用,构建“药物-靶点-疾病”网路。3.将PPI分析获得的关键蛋白质靶点对应到KEGG中治疗的疾病目录和涉及的主要信号通路,构建“成分-靶标-通路-疾病”网路,通过富集因子(Rich factor)、P值分析衡量疾病通路富集程度。4.从PDB数据库下载重要靶点蛋白的三维结构数据,使用分子对接软件AutoDock将芒果苷和这些靶点进行正向分子对接检测,计算受体与配体的结合自由能。结果1.根据PharmMapper数据库筛选结果,获得了芒果苷的600个靶点的信息,根据匹配度分值排序,最终确定了 90个潜在分子靶点。2.蛋白相互作用网络分析结果显示70个靶点蛋白之间产生了相互作用。在蛋白相互作用网络核心区域,多个靶点之间产生了密集的相互作用。芒果苷与潜在靶点的相互作用分析显示芒果苷药效团可以作用于很多靶点基因,提示了芒果苷多靶点的作用特点。3.在KEGG富集分析共筛选出68个基因,涉及28种相关疾病和信号通路。靶点基因在丝裂原激活蛋白激酶通路和多个癌症致病通路中高度富集。在这些信号通路中TGFβ RII、CASPS3、JNK和EGFR显示为关键的节点蛋白。4.芒果苷和TGFβ RII、CASPS3、JNK和EGFR的正向分子对接结果显示四种蛋白靶点与芒果苷之间均显示出一定的结合潜能,其中,JNK具有更高的结合潜力。结论芒果苷具有多靶点药理作用的特点,还与肿瘤发生相关信号通路中的关键节点蛋白有高度结合的潜力。计算模拟角度预测芒果苷能够合理作用于这些靶点蛋白,提示芒果苷具有抗肿瘤活性的结构基础。分子对接显示TGFβ RII、CASPS3、JNK和EGFR可能是芒果苷抗肿瘤作用的关键靶点。第三部分 芒果苷靶向JNK抑制甲状腺癌TPC-1细胞增殖及诱导细胞凋亡研究目的对芒果苷与JNK蛋白靶向结合的作用做进一步验证,论证芒果苷抗肿瘤作用的分子机制和靶向JNK抑制TPC-1细胞增殖、诱导凋亡的作用。研究方法1.采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT assay)检测芒果苷及JNK通路抑制剂SP600125对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖的影响。2.流式细胞法检测(FCM)芒果苷及JNK通路抑制剂SP600125对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞凋亡的影响。3.蛋白质印迹法(Western blot)检测芒果苷及JNK通路抑制剂SP600125处理对 TPC-1 细胞 JNK、p-JNK、FasL、Bid、Bax、Bcl-2、caspase-3 表达的影响。4.实时荧光定量PCR(qPCR)检测TPC-1细胞JNK的mRNA水平结果1.芒果苷对TPC-1细胞的增殖的抑制呈时间依赖性,但在24小时后细胞增殖下降的程度逐渐变缓。在72h时间点测得的半数抑制浓度(IC50)为3.92μM。SP600125可以抑制TPC-1细胞增殖,抑制效果呈浓度和时间依赖性。在72h时间点计算出的IC50值为117.89nM。2.流式细胞学检测各组细胞的凋亡率,对照组与SP600125组相比较细胞凋亡率无明显差异,对照组与芒果苷组相比较细胞凋亡率有显著性差异,与对照组相比联合用药后细胞凋亡率仍有明显增加。3.芒果苷的处理抑制了 JNK和p-JNK的表达,随着芒果苷浓度的增加,其对JNK和p-JNK表达的抑制逐渐增强,但对p-JNK的抑制更为显著。SP600125的处理显著抑制了 p-JNK的表达,芒果苷与SP600125具有协同作用。SP600125和芒果苷的单药处理下调了凋亡相关蛋白FasL、Bid、Bcl-2和Bax的表达,芒果苷单药对Bcl-2的抑制更为明显,同时还可以明显降低Bcl-2/Bax的比值。SP600125的单药处理明显降低了凋亡执行蛋白caspase-3的表达,而芒果苷处理后caspase-3的表达与对照组相比有所增加。4.实时荧光定量PCR检测JNK mRNA在TPC-1细胞内的表达水平,与对照组相比,不同浓度的芒果苷处理后JNK mRNA在TPC-1细胞内的表达无明显差异。结论芒果苷通过与JNK蛋白的靶向结合,影响了 JNK的磷酸化。通过对JNK信号通路活性的抑制,芒果苷抑制了 TPC-1细胞的增殖。与JNK信号通路特异性抑制剂SP600125相比,芒果苷通过调节促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的比例及上调caspase-3的表达诱导了 TPC-1细胞的凋亡。芒果苷促凋亡的作用还可能与其靶向调控的其他目标分子的影响有关。