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IAPs,统称为凋亡抑制因子(Inhibitors of apoptosis),最初在杆状病毒中作为一类抗凋亡蛋白被发现,之后在其他物种(如哺乳动物,果蝇,线虫等)中也发现了它们的身影。在杆状病毒中,IAPs是调控宿主细胞凋亡进程的一大类蛋白,目前根据其氨基酸序列的同源性将其分为六类(IAP1-6)。各类IAPs的结构相似,功能却不尽相同,有些IAP有促凋亡活性。宿主通过启动其凋亡程序来抗病毒感染,而病毒又通过抑制细胞凋亡,来促进其自身的增殖传播。为明确IAPs在苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)抗虫过程中的作用机制,我们开展了Ac-IAPs的功能研究,并在此基础上,探讨了Ac-IAP1/2对重组病毒AcMNPV-BmK IT(P10)细胞毒性的协同效应。本研究分为三部分:第一部分:凋亡抑制因子Ac-IAP1/2的功能分析。我们首先利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒重组表达系统构建了过表达Ac-IAP1/2的重组病毒AcMNPV-iap1/2-egfp。然后分别用1 MOI的重组病毒AcMNPV--iap1/2-egfp感染Sf9细胞,荧光显微镜观察与Western blot分析结果表明,Ac-IAP1/2-EGFP的表达量随着感染时间的延长而逐渐增加,并在120 h达到最大。接着,分别用0.001 MOI的野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-iap1/2-egfp感染Sf9细胞1-4天,蚀斑实验检测不同处理组细胞和培养液中子代病毒粒子的数量,结果表明AcMNPV-iap2-egfp促进子代病毒增殖;而AcMNPV-iap1-egfp抑制子代病毒增殖,表明Ac-IAP2可促进子代病毒增殖,而Ac-IAP1则执行相反的功能。之后,分别用1.5-12 MOI的AcMNPV和AcMNPV-iap1/2-egfp感染Sf9细胞48 h,MTT试剂检测Sf9细胞的增殖情况,结果表明AcMNPV-iap2-egfp以剂量-依赖的形式促进细胞增殖;AcMNPV-iap1-egfp无论在正常条件还是营养胁迫条件下,均显著抑制细胞增殖。这表明Ac-IAP1具有诱导细胞凋亡的活性,Ac-IAP2则可促进细胞增殖。在抗虫实验中,分别用20μL,1×107 pfu/mL的AcMNPV-egfp和AcMNPV-iap1/2-egfp连续饲喂三龄期棉铃虫幼虫五天,检测棉铃幼虫的生长情况、死亡率及蛹化率。结果表明,由AcMNPV-iap2-egfp饲喂的棉铃虫,不仅生长缓慢,死亡率也远高于其他两个病毒处理组。而AcMNPV-iap1-egfp饲喂的棉铃虫,死亡率和化蛹率与野生荧光标签病毒AcMNPV-egfp处理组相差无几,表明Ac-IAP1尽管表现出较强的细胞毒性,但过表达Ac-IAP1的病毒AcMNPV-iap1-egfp的杀虫效果不佳,而AcMNPV-iap2-egfp则具有较高抗虫活性。第二部分:BIR2结构域对于Ac-IAP2的抗凋亡功能至关重要。采用GenBank和PDB数据库检索Ac-IAP1/2的功能域,DNAMAN软件比对分析并确定Ac-IAP1/2间序列差异较大的功能域为BIR2结构域。我们通过重叠PCR技术将Ac-IAP2的BIR2结构域置换为Ac-IAP1的BIR2结构域,并用Bac-to-Bac昆虫表达系统构建了过表达Ac-IAP2突变体Ac-IAP2-BIR2(iap1)的重组病毒AcMNPV--iap2-BIR2(iap1)-egfp。然后,用1 MOI的AcMNPV-iap2-BIR2(iap1)-egfp感染Sf9细胞,荧光显微镜观察与Western blot结果表明,随着感染时间的延长,被感染的细胞(即带绿色荧光的细胞)显著增多、细胞的荧光强度显著增强,Ac-IAP2-BIR2(iap1)-EGFP的表达量增加,并在120 h达到最大。接着,分别用3-12 MOI的AcMNPV-iap1/2-egfp和AcMNPV-iap2-BIR2(iap1)-egfp感染Sf9细胞48 h,MTT试剂检测Sf9细胞的增殖情况,结果表明,与AcMNPV-iap2-egfp仅差一个BIR2功能域的AcMNPV-iap2-BIR2(iap1)-egfp却具有比AcMNPV-iap1-egfp更高的细胞增殖抑制率。这表明Ac-IAP2-BIR2(iap1)促进细胞凋亡,BIR2结构域对于Ac-IAP2的抗凋亡功能至关重要。第三部分:Ac-IAP1/2对重组病毒AcMNPV-BmK IT(P10)促凋亡活性的协同效应分析。前两部分实验已经对Ac-IAP1/2的功能作了分析,那么作为调控宿主细胞凋亡的两个重要因子,它们是否可提高我们已有的重组蝎昆虫特异性毒素(BmK IT)的AcMNPV-BmK IT的细胞毒性?鉴于我们前期的研究,早期启动子(IE1)调控表达的BmK IT在病毒感染早期可促进子代病毒增殖,而早期(IE1)和晚期启动子(P10)调控表达的BmK IT均可促进细胞凋亡。本节中,我们首先分析了晚期启动子(P10)调控表达的BmK IT对子代病毒增殖的影响。分别用1 MOI的AcMNPV和AcMNPV--BmK IT(P10)侵染Sf9细胞,结果显示在16-48 h内,AcMNPV-BmK IT(P10)处理组细胞中的病毒粒子积累量均低于野生病毒处理组,表明AcMNPV-BmK IT(P10)可抑制子代病毒在宿主细胞内的累积。接着,用1 MOI的AcMNPV-BmK IT(P10)侵染Sf9细胞,Real-time PCR结果表明,BmK IT的转录水平在病毒感染24 h后,呈减弱趋势。而在病毒感染48 h时宿主细胞内的子代病毒粒子积累量有一个轻微的增长,这表明BmK IT是抑制宿主细胞内子代病毒粒子积累的原因;之后,用1 MOI的AcMNPV和AcMNPV-BmK IT(P10)侵染Sf9细胞,Real-time PCR结果表明在病毒感染早期AcMNPV-BmK IT(P10)处理组中vp39基因的转录水平高于野生病毒处理组,而感染晚期与之相反。上述结果共同表明P10启动子调控表达的BmK IT,在病毒感染早期,促进子代病毒增殖和出芽,而在感染晚期促进细胞凋亡、抑制子代病毒的增殖,利于子代病毒传播。接着,分别用10 MOI的AcMNPV和AcMNPV-Bm K IT(P10)侵染Sf9细胞,DAPI荧光染色结果显示,两病毒处理组的细胞核形态和大小没有明显差异,表明重组病毒AcMNPV-BmK IT(P10)对子代病毒增殖和出芽的影响,并不依赖存在于细胞核中病毒发生基质的形成。在明确了AcMNPV-BmK IT(P10)在宿主细胞内增殖的规律后,我们检测了Ac-IAP1/2对重组病毒AcMNPV-BmK IT(P10)促细胞凋亡活性的协同效应,分别用AcMNPV-iap1/2-egfp(3 MOI)与AcMNPV-BmK IT(P10)(1.5、3和6 MOI)共侵染Sf9细胞,结果表明,Ac-IAP1可协同AcMNPV-BmK IT(P10)促进宿主细胞凋亡,且其细胞毒性高于BmK IT;Ac-IAP2通过抑制细胞凋亡为BmK IT促进子代病毒增殖争取了时间,使得子代病毒大量增殖,从而提高了AcMNPV-BmK IT(P10)的细胞毒性。本研究分别在虫体和细胞水平上分析了AcMNPV侵染宿主过程中调控宿主凋亡的关键因子Ac-IAP1/2的功能,明确了BIR2结构域对Ac-IAP2抗凋亡功能的重要性,获得了一株抗虫效率较高的病毒杀虫剂AcMNPV-iap2-egfp,并进一步完善了AcMNPV-BmK IT(P10)细胞毒性机制及IAPs对其协同效应的研究。本研究为杆状病毒IAPs的机制研究及应用提供了实验依据,对科学防治鳞翅目害虫具有重要意义。