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研究目的及依据
药代动力学(PK)和药效动力学(PD)是药理学研究的两个重要概念,PK描述不同体液中药物浓度随时间变化的过程,PD描述药效随效应部位药物浓度变化的过程。虽然PK和PD是在同一个生物个体、随时间同步发生的两个动力学过程,值常规的药理学研究方法,难以将两者有机结合并同时研究,因此,难以正确地反映药物浓度.靶部位效应.时间的三维关系。应用微透析技术对清醒或麻醉动物的血液及其他靶部位进行连续、同步采样的方法,为PK-PD的结合研究提供了可能的手段[1]。
帕金森病是一种黑质纹状体系统多巴胺(dopamine,DA)神经功能受损所致DA与乙酰胆碱平衡失调的一种慢性疾病,以运动迟缓、静止性震颤和强直为主要特征。其治疗一般采用以左旋多巴(levodopa,L-DOPA)为主的替代疗法,可以减轻患者症状,延缓病程进展。但随着治疗时间延长,L-DOPA疗效逐渐减弱,副作用逐渐增强,成为临床治疗棘手的问题。中医药辨证论治和中西医结合治疗帕金森病的实践证明,中药有一定的改善临床症状的疗效,或可以增加西药治疗作用、减轻其副作用,提高患者生存质量,首乌方就是经临床验证有效的中药复方专一[2]
本实验通过建立血、脑双位点微透析采样方法,结合高效液相色谱一荧光检测技术(HPLC-FLD),同体、同步监测清醒、自由活动大鼠血液中L—DOPA浓度与脑内纹状体细胞外液氨基酸类神经递质水平的变化,探讨L-DOPA血药浓度-靶器官效应-时间的关系,进而探讨首乌方协同L-DOPA治疗帕金森病的作用机理。
研究方法
1 HPLC-FLD法测定清醒自由活动大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质水平应用氨基酸分析柱(Eclipse AAA4.6×150 mm,5μm)和邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生化方法。流动相:A液为缓冲液:甲醇:四氢呋喃(V:V:V)=400:95:5；B液为缓冲液:甲醇(V:V)=120:380,二元梯度洗脱。缓冲液为20 mM乙酸钠溶液(PH7.2):流速:0.8 mL·min-1；增益:12；分离后的氨基酸衍生化合物用荧光检测器进行检测,激发波长:340 nm,发射波长:455 nm。
2 HPLc-FLD法测定清醒自由活动大鼠血液中游离L-DOPA水平色谱柱为MERCK Lichrospher100 C18(5μm,250 mm×4 mm),预柱Nova-Pak C18；柱温:35℃；激发波长278 nm,发射波长325 nm；流动相为水:甲醇(90:10),其中水相含EDTA.0.08 mmol·L-1,KH2PO470 mmol·L-1,庚烷磺酸钠2.08mmol·L-1。流速1.0 ml·min-1。
3大鼠纹状体定向注射6-OHDA造成帕金森病大鼠模型微透析采样的前7天,大鼠用戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,立体定位仪定位于大鼠右侧纹状体(A:+0.2 mm,R:+3 mm,V:7.5 mm),埋入探针套管,并将0.2％的6-OHDA生理盐水溶液以32μg·kg-1、1μl·min-1的速度注入,造成脑内单点注射6-OHDA所致的帕金森病大鼠模型。对照组注射相应体积的生理盐水。
4血、脑双位点微透析准备及操作过程大鼠脑部微透析探针套管埋置手术参见6-OHDA造模。血液探针置入手术于微透析前一天进行:麻醉下,经大鼠左侧颈静脉插入并固定,用1％的肝素钠生理盐水溶液灌流30 min,流速2.0μl·min-1,之后改用复方氯化钠灌流。大鼠腹腔埋植导管,从背部引出并固定,用于微透析过程中大鼠腹腔给药。次日,于大鼠清醒自由活动状态下插入脑部探针。血液探针和脑部探针用复方氯化钠以2.5μl·min-1的速度灌流平衡60 min之后,脑探针的灌流液改为5 mmol·L-1的水杨酸钠林格氏液,平衡60 min后,开始采样:收集透析液,每15 min收集管。采样60 min后,经腹腔导管投与美多芭,高剂量组60mg·kg-1、低剂量30 mg·kg-1；模型组、对照组给予相应体积的生理盐水。动态观察血、脑微透析液中相关指标共420 min。实验过程见图1。
研究结果
1 HPLC-FLD检测清醒自由活动大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质的方法同日内测定Glu、GABA标准,相对变异系数(RSD)值依次为:Glu:0.52％；GABA:1.57％(n=5)。用250.0～2.0μg·L-1的氨基酸混合标准进行测定,线性关系良好,相关系数(R2)依次为:Glu:0.9996；GABA:0.9990。清醒大鼠纹状体微透析液中五种氨基酸均有较好的峰高和峰面积响应值标准和透析液的色谱图几乎无杂峰干扰。
2 HPLC-FLD检测清醒大鼠血液中L-DOPA水平的方法同日内测定三个浓度:5、125、0.3125 mg·L-1的L-DOPA标准,RSD值依次为:1％,0.6％,3.8％(n=5)。用5.0～0.078125mg·L-1的各个浓度的标准样品进行测定,线性关系良好,相关系数(R2)为:0.99962,最低检测限为0.38 ng。
3血液中L-DOPA的药代动力学研究大鼠腹腔给药后,药物迅速吸收入血,各时间点所测得的L-DOPA血药浓度.时间曲线符合一室模型。美多芭高、低剂量模型组和高剂量对照组的AUC分别为1761.33±225.73,668.31±91.85和2407.67±160.72 mg·L-1min-1；t1/2z分别为56.62±9.18,66.05±10.77和160.68±17.67min；Cmax分别为18.31±2.53,9.67±1.06和24.69±2.31 mg·L-1；Tmax分别为45,33±6.71和45 min。
4帕金森病模型大鼠纹状体细胞外液Glu、GABA水平的动态变化及美多芭对其的影响造模后一周,与对照组相比,模型组Glu水平明显升高,其中有10个时间点有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。GABA水平显著降低,其中有4个时间点有显著性差异(_P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,美多芭低剂量模型组和美多芭高剂量模型组的Glu水平均显著降低,分别有13个时间点和12个时间点有显著性差异(P<0.05或P<0.01),而GABA水平则升高,分别有7个和14个时间点有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。
5大鼠血液中L-DOPA药动学与靶器官药效学指标的相关性L-DOPA药动学指标选择大鼠血液中L-DOPA药物浓度,靶器官的药效学指标选择大鼠纹状体细胞外液的Glu水平(以基础值的百分率表示)。对各相同时间点药动.药效指标的同步变化进行相关性动态分析(回归性分析),美多芭低剂量组和美多芭高剂量组的R2值分别为0.7332和0.8055；以血液中L-DOPA的浓度变化与大鼠纹状体细胞外液Glu与GABA的比值进行上述相关性动态分析,美多芭高剂量组两者的相关系数R2值为0.7950。
6首乌方(SWF)对大鼠血液中L-DOPA药代动力学的影响与美多芭低剂量模型组比较,SWF+美多芭低剂量模型组有8个时间点的L-DOPA浓度显著升高(P<0.01或P<0.05)。
7首乌方(SWF)对大鼠纹状体细胞外液GIu/GABA水平的影响与模型组相比,美多芭低剂量模型组大鼠脑内纹状体细胞外液的Glu/GABA有9个时点显著降低,SWF+美多芭低剂量模型组有8个时点有显著降低(P<0.05或P<0.01)；SWF+美多芭低剂量模型组与美多芭低剂量模型组相比,各时点的Glu/GABA没有显著性差异,但该组的动态变化趋势更加接近正常对照组。
结论
本实验建立了大鼠血、脑双位点微透析采样、高效液相色谱.荧光检测脑细胞外液氨基酸类神经递质和血液L-DOPA水平的技术方法,成功地对清醒、自由活动大鼠血液中L-DOPA浓度与效应部位(脑内纹状体)细胞外液兴奋性氨基酸Glu、抑制性氨基酸GABA水平的变化进行了相同生物个体的同步动态监测,分析了L-DOPA血药浓度.靶器官效应.时间的相关性,发现了首乌方协同L-DOPA治疗帕金森病的作用机理之一与增加其血药浓度有关。