论文部分内容阅读
目的：紧密连接存在于血管内皮细胞及各类上皮细胞之间，常围绕上皮细胞或内皮细胞的顶端呈连续带状,使相邻的细胞紧密连接在一起，形成细胞间天然的物理屏障，起着选择性通透和维持细胞极性、维持细胞内环境稳态及参与细胞增殖的作用。肾素血管紧张素（RAS）系统在心血管疾病的发生发展中发挥着重要作用，血管紧张素Ⅱ是RAS系统中最重要的效应因子之一，AngⅡ是一种内源性多肽，在生理条件下维持心血管系统的内稳态。在病理条件下，通过激活多条信号通路来参与心肌肥大、血管内膜增生、心脏重塑等心血管疾病的发生与发展。Krüppel样因子5（krüppel-like factor5, KLF5）是一种含有锌指结构的转录调节因子,其C-末端的3个锌指结构域是DNA结合域，N端主要发挥转录激活作用。通过调节不同的信号通路来诱导相关因子的表达，进而引起细胞生物学效应，如参与细胞增殖和分化、炎症反应和细胞凋亡，是生物体内重要的信号转导系统之一。通心络（TXL）胶囊是依据传统中医的络病理论研制而成的复方制剂。它由动物药、植物药等12味中药组成，1996年被中国国家食品药品管理局批准用于治疗冠心病和缺血性脑中风。既往研究证明，通心络具有强效的血管保护作用，例如改善内皮细胞功能、降低血脂、抑制炎症、防治动脉粥样硬化和促进血管新生。但通心络对内皮细胞保护作用的机制还不是很清楚，本文主要研究通心络对内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响及其作用机制。方法：Western blot分析和免疫组化检测AngⅡ及TXL对KLF5和紧密连接蛋白表达的影响； Real-time PCR检测KLF5mRNA和紧密连接蛋白mRNA表达水平。结果：1AngⅡ抑制KLF5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin表达Western blot分析显示，加入AngⅡ刺激后，KLF5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的表达水平下降。Real-timePCR结果也显示，与对照组相比，AngⅡ刺激后，KLF5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的mRNA表达水平下降。这些结果表明, AngⅡ抑制KLF5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的表达。2TXL能够浓度依赖性的逆转由AngⅡ诱导的KLF5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的表达下调为了研究TXL对KLF5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的影响，我们用不同浓度的TXL预孵育细胞24h，然后再给予AngⅡ刺激24h。Western blot分析结果显示，随着TXL浓度增加，KLF5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin表达水平呈剂量依赖性升高，于600μg/ml达到高峰。血管紧张素原转基因小鼠腹主动脉免疫组化染色也显示，与对照组相比，TXL组KLF5和紧密连接蛋白表达明显上调。3过表达KLF5促进内皮细胞紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin和occludin表达Western blot结果显示，过表达KLF5后紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin和occludin的表达显著增多，而敲低KLF5使其表达水平下降。Real-time PCR结果与Western blot结果相一致。这些结果提示，KLF5介导内皮细胞紧密连接蛋白基因的表达。4敲低KLF5阻断由TXL引起的紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin和beta-catenin的表达上调上述结果表明，敲低KLF5后使紧密连接蛋白表达下调。为了检测TXL对紧密连接蛋白表达的上调是否由转录因子KLF5介导，我们先用预TXL孵育细胞24h，然后用靶向KLF5的siRNA转染内皮细胞，检测TXL对敲低KLF5的内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响。Western blot分析结果显示，在敲低KLF5内皮细胞中，TXL不能再上调紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的表达。结果表明，通心络通过上调KLF5而使紧密连接蛋表达增加。结论：1AngⅡ抑制KLF5和紧密连接蛋白VE-cadherin、occludin、beta-catenin的表达。2TXL浓度能够浓度依赖性的逆转由AngⅡ诱导的KLF5和紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin及beta-catenin的表达下调。3过表达KLF5促进紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin和occludin的表达4敲低KLF5阻断由TXL引起的紧密连接蛋白VE-cadherin、claudin、occludin和beta-catenin的表达上调。