研究背景早产是指妊娠满28周至不足37周间分娩者,是产科较为常见的并发症之一。在中国,早产的发生率达6-7%,死亡率达12.7%-20.8%。早产的病因主要包括：胎膜早破,绒毛膜羊膜炎；妊娠并发症；子宫过度膨胀及胎盘因素；子宫畸形；下生殖道及泌尿系感染；宫颈内口松弛等。其中未足月胎膜早破是早产的主要原因之一,属于妊娠期并发症。目前,早产的预防和治疗仍是个难题。胎膜早破是指胎膜在临产前发生破裂,而胎膜早破在足月前发生则称为未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membranes, PPROM)。尽管经过积极保胎处理,但仍有约50%的早产胎膜早破孕妇在胎膜破裂后1周内分娩,是早产的主要原因。研究表明,大约30-40%的早产与PPROM有关。近年来,其发病率逐渐增加,发生率为2.0%到3.5%。PPROM作为占早产主要原因的产科并发症,早预测早预防具有重大临床意义。及时恰当地处理未足月胎膜早破能一定程度降低早产率,提高孕／产妇及新生儿生存率;对母婴预后有重要影响。早产常与胎膜早破共同存在,胎膜早破成为早产发生的重要原因。因此,对PPROM的高危因素进行分析,对其发病机制进行探讨,针对病因及发病机制进行预防和诊治具有非常重要的临床意义。胎膜由羊膜、绒毛膜以及两者膜之间的细胞外基质(ECM)组成。国内外大量的研究表明,基质金属蛋白酶(MMPs)是降解细胞外基质(ECM)中所有蛋白质组分的一种内源性酶。MMPs降解细胞外基质中的相应成分,可影响细胞外基质含量及胎膜结构,进而使胎膜组织结构被弱化,从而促使胎膜早破的发生。研究也发现,分娩机制启动后,胎膜组织中MMP的活性明显增加,特别是MMP-9表达增加最为明显。该研究表明,活跃期羊水中的MMPs,特别是MMP-9活性增强,会导致胎膜中胶原纤维被大量降解,这也可能是胎膜破裂的一个重要生理基础。目前,虽然随着研究的深入,未足月胎膜早破的部分病因研究逐渐明确,但MMPs升高的原因至今仍不明确。因此探讨其升高的分子生物学机制可能是分析和发现PPROM病因的关键。基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是一种具有多种生物学活性的低分子量蛋白,它们更是组织金属蛋白酶抑制因子。TIMPs通过两个方面发挥其抑制MMPs活性的作用：一、直接使活化的MMP形成紧密复合体；二、在酶原活化阶段,MMP与TIMPs形成复合体,酶原自我激活受阻。研究表明,TIMPs涉及多种细胞因子及网络调节,并参与人体多种生理或病理过程,在细胞凋亡、肿瘤调控及移植物慢性排斥反应中发挥重要作用。有研究表明,TIMP在PROM患者羊水中的含量明显低于正常孕妇,胎膜感染过程中,MMP活性增加的同时,TIMP的表达水平也明显降低。因此,低水平TIMP可促进MMP的表达并增强其活性,MMP/TIMP失衡可能是PROM发生的重要机制。但目前,运用TIMPs作为基因治疗的工具仍处于一个早期探索阶段,无相应理论支持。P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)是丝氨酸／苏氨酸激酶家族的成员之一。有研究发现多种刺激因素通过P38 MAPK信号转导途径使其活化,进而调节MMPs和TIMPs.而P38 MAPK信号通路在PPROM发生中具体分子机制尚有待探讨。总之,目前PPROM与其胎膜组织上的基质金属蛋白酶在分子上的调控机制尚不完全明确。本课题将从分子水平上研究PPROM的发生与其胎膜组织上MMPs表达水平之间的相关性,并进一步探讨PPROM与基质金属蛋白酶基因多态性之间的相关性,同时,结合MMPs/TIMP与P38 MAPK的关系,探讨PPROM的发病机制,为PPROM的早预测早预防提供临床诊治依据,提高母婴生存率及生存质量。第一章MMPs与胎膜早破相关性研究目的检测胎膜完整足月妊娠组(简称足月妊娠组),未足月胎膜早破早产组(简称未足月早破组),胎膜早破足月妊娠组(简称足月早破组)及胎膜完整早产组(简称早产组)胎膜组织中基质金属蛋白酶(MMPs)mRNA及蛋白的表达水平,并探讨MMP-9, MMP-8和MMP-2与未足月胎膜早破相关性。方法选择足月早破组(20例),未足月早破组(20例),足月妊娠组(20例),早产组(20例),采用实时荧光定量PCR检测MMP-9, MMP-8和MMP-2 mRNA表达水平,并采用免疫印迹检测MMP-9, MMP-8, MMP-2蛋白表达水平。结果定量PCR结果显示,未足月胎膜早破组与足月妊娠组相比较,MMP-9、MMP-8、MMP-2 mRNA表达水平升高,足月早破组与足月妊娠组相比较,MMP-9、MMP-8、MMP-2 mRNA表达水平升高,早产组与足月妊娠组相比较,MMP-8、MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平升高,未足月胎膜早破组与足月早破组相比较,MMP-8、MMP-2表达水平升高,MMP-9 mRNA表达水平无明显统计学差异。免疫印迹结果显示,未足月胎膜早破组、足月早破组、早产组与足月妊娠组相比较,MMP-9、MMP-8、MMP-2蛋白表达水平显著增加,且在未足月胎膜早破组中增加最为显著。结论MMP-9、MMP-8、MMP-2在胎膜早破产妇胎膜组织高表达,提示MMPs可能参与胎膜早破发病过程。第二章P38MAPK, MMP-9和TIMP-1与胎膜早破相关性研究目的检测足月妊娠组,未足月胎膜早破组,足月早破组,早产组胎膜组织中P38,MMP-9和TIMP-1mRNA及蛋白的表达水平,并探讨P38, MMP-9和TIMP-1与未足月胎膜早破相关性。方法选择足月早破组(20例),未足月早破组(20例),足月妊娠组(20例),早产组(20例),采用免疫组化检测P38, MMP-9和TIMP-1蛋白表达水平；定量PCR法检测P38, MMP-9和TIMP-1 mRNA表达水平；免疫印迹法检测P38,MMP-9和TIMP-1蛋白表达水平。结果免疫组化结果显示,P38和MMP-9在足月妊娠组中低表达,在足月早破组和未足月早破组高表达；TIMP-1在足月妊娠组中高表达,在未足月早破组明显低表达。定量PCR结果显示,未足月胎膜早破组与足月妊娠组相比较,P38,MMP-9 mRNA表达水平升高,TIMP-1 mRNA表达水平降低；足月早破组与足月妊娠组相比较,P38, MMP-9 mRNA表达水平升高,TIMP-1 mRNA表达水平降低；早产组与足月妊娠组相比较,P38, MMP-9 mRNA表达水平升高；未足月胎膜早破组与早产组相比较,P38 mRNA表达水平升高,TIMP-1 mRNA表达水平降低；未足月胎膜早破组与足月早破组相比较,P38mRNA表达水平升高。免疫印迹结果显示,未足月胎膜早破组、足月早破组、早产组与足月妊娠组相比较,P38和MMP-9蛋白表达水平显著增加,且在未足月胎膜早破组中增加最为显著；TIMP-1蛋白表达水平在早产组、足月早破组、未足月胎膜早破组逐渐降低。结论P38和MMP-9在胎膜早破产妇胎膜组织高表达,TIMP-1在胎膜早破产妇胎膜组织低表达。第三章P38 MAPK调控MMP-9和TIMP-1在人羊膜上皮细胞中功能的研究目的研究P38在人羊膜上皮细胞中对MMP-9和TIMP-1mRNA及蛋白表达水平的影响,及P38对人羊膜上皮细胞增殖,周期和凋亡能力的影响。方法选取人羊膜上皮细胞HAEpiC为研究对象,免疫荧光的方法检测HAEpiC人羊膜上皮细胞的特定标记物CK-19,流式细胞仪检测HAEpiC细胞中CD9,CD10, CD29, C73, cytokeratin, CD34, CD38和CD44的阳性率。P38抑制剂处理HAEpiC细胞,定量PCR和免疫印迹检测P38抑制剂SB203580对MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白表达水平的影响。siRNA干扰P38后,定量PCR和免疫印迹检测P38沉默对MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白表达水平的影响。CCK-8检测P38沉默对人羊膜上皮细胞HAEpiC增殖能力的影响。流式细胞仪检测P38沉默对人羊膜上皮细胞HAEpiC周期及凋亡能力的影响。结果98%HAEpiC细胞CK-19呈阳性,HAEpiC细胞中CD9, CD10, CD29, CD73和cytokeratin表达呈阳性；CD34, CD38和CD44表达呈阴性。P38MAPK抑制剂SB203580处理后,P38, MMP-9的mRNA及蛋白表达水平明显降低,TIMP-1的mRNA及蛋白表达水平明显升高。P38干扰后,P38, MMP-9的mRNA及蛋白表达水平也明显降低,TIMP-1的mRNA及蛋白表达水平也明显升高。CCK-8结果显示,与对照组相比,P38干扰组细胞增殖能力明显增强。凋亡实验显示,与对照组相比,P38干扰组细胞凋亡水平明显降低。同时,P38干扰可以使G1延长,及S期细胞的明显增加,P38干扰可能是通过诱导细胞S期阻滞。结论P38调控人羊膜上皮细胞MMP-9和TIMP-1的表达水平,P38的表达影响人羊膜上皮细胞增殖,周期,和凋亡能力。表明P38-MAPK-MMPs/TIMPs级联信号通路在未足月胎膜早破的发病中起到重要作用；靶向P38-MAPK-MMPs/TIMPs级联信号通路有可能成为防治未足月胎膜早破的潜在治疗方法。