高蛋白血症是一种循环血液系统蛋白质含量异常升高的重大代谢疾病,临床多见于肝硬化、多发性骨髓瘤、血管肉瘤病、代谢性酸中毒、肾病,以及腹膜炎、慢性淋巴瘤、腹腔脓肿和线虫感染等疾病的并发症。由于临床很难区分高蛋白血症与原发疾病或感染对机体的影响,已有的报道仅限于对血液理化性质影响等基础数据收集,以及比较高蛋白血症与低蛋白血症、高血糖和高脂血症等常见代谢疾病的基础数据差异,缺乏对相关病理机制的研究。目前为止,还没有可靠的高蛋白血症疾病动物模型与建模方法,高蛋白血症的发病机制与临床治疗方法研究、治疗药物开发一直停滞不前。因此,亟需开发出可靠的高蛋白血症动物模型和建模方法。为此,本文在本研究室已有的研究基础上,利用中国特色的无脊椎模式动物家蚕,重建了高蛋白血症动物模型,调查了高血浆蛋白浓度(PPC)对血液代谢以及血液系统先天免疫的影响,评估了高PPC对代谢和解毒组织脂肪体的重塑发育的损害及影响机制,并进一步研究了高PPC对生殖毒性这一机体长期影响的调控机制。主要研究结果如下:(1)高蛋白血症疾病模型的重建基于研究室已有的工作基础,通过封堵家蚕成熟幼虫的吐丝孔,阻止丝腺中的丝蛋白质向体外分泌,进一步利用变态发育过程中丝腺的退化解离过程,使丝腺内的大量丝蛋白质快速释放到循环系统,导致血浆蛋白浓度(PPC)水平极速升高,并持续高于对照家蚕7倍以内,构建出致死率从0%至100%可控的不同程度的家蚕高蛋白血症疾病模型。高PPC导致家蚕变态发育过程中化蛹变态异常,重症模型最终全部死亡。血液生化检测结果表明,模型组家蚕的PPC逐渐升高,但血糖、血清甘油三酯和血清总胆固醇浓度无统计意义的显著变化。表明重建了无原发症影响、PPC水平可控的高蛋白血症家蚕模型(AM)。(2)高血浆蛋白浓度对血淋巴代谢的影响血淋巴代谢组学分析结果显示,高PPC引起显著变化的差异代谢物主要富集在氨基酸代谢通路,包括丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等。代谢通路整合分析发现,糖酵解途径、脂质代谢、TCA循环以及尿素循环等代谢途径也发生了显著的变化。其中氨基酸代谢出现整体上调的现象,多种重要的氨基酸,如色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、精氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺等都显著升高。糖代谢也出现了上调,但脂质代谢和TCA循环出现了下调的现象,尿素循环产生的尿素含量也显著降低。显示高PPC促进了氨基酸代谢,但却降低了机体整体的代谢水平。(3)高血浆蛋白浓度影响家蚕血液系统先天免疫代谢和解毒组织脂肪体的转录组学免疫分析结果显示,GO分析和KEGG分析发现高PPC导致了参与先天免疫应答的抗菌肽(AMPs),及其调控NF-κB信号途径相关的基因转录水平发生了显著变化。进一步血浆抗菌活性实验结果表明,高PPC提高了血淋巴对E.coli的抗菌活性,但却抑制了对S.aureus的抗菌活性。高PPC诱导血细胞和脂肪体中6种类型的AMPs基因m RNA水平显著上调,其中血细胞中的defensin基因m RNA水平在建模处理后192 h比CK组升高了2300倍。而AMPs的上调表达,则是受到NF-κB信号中Toll途径和Imd途径的调控。高PPC导致血淋巴中循环血细胞的类型出现显著变化,其中承担免疫功能的颗粒细胞在血细胞总数中的比例升高了1倍左右。高PPC还通过抑制酚氧化酶原PPO1、PPO2的m RNA表达,进而抑制了PO活性,降低血淋巴的黑化免疫作用。(4)高血浆蛋白浓度影响代谢组织脂肪体的重塑发育以代谢和解毒组织脂肪体(FB)为对象,以幼虫化蛹变态过程脂肪体形态和功能重塑发育为靶标的调查结果显示,高PPC阻碍了FB的重塑再生发育过程,重塑过程延迟了48 h以上。致病机制研究结果显示,高PPC通过减弱内分泌激素的作用,减弱FB组织的细胞自噬和凋亡作用,阻止变态发育期FB重塑再生;同时高PPC诱发了FB组织氧化应激压力增大、氨基酸转化功能紊乱。建模处理后补充内分泌蜕皮激素的活性物质20-羟基蜕皮酮,能够有效拯救高PPC诱导的FB组织受阻的重塑再生过程,并且蜕皮激素作用信号途径相关基因Bm Ec R和Bm E74A、组织解离相关酶基因Bm Cat B和细胞自噬凋亡信号途径相关基因Bm Atg6、Bm Atg8和Bm Dronc的m RNA水平均有一定程度的恢复(5)高血浆蛋白浓度对生殖发育的影响高PPC对家蚕具有深远意义的生殖发育的影响的调查结果显示,高PPC显著降低了雌性家蚕产卵的数量和质量。进一步研究表明,高PPC抑制了雄性精巢和雌性卵巢的发育,包括生殖腺系数降低、发育延迟。同时,生精囊体外培养实验结果表明,雄性生殖腺经历过高蛋白血淋巴环境后,即使脱离了高PPC环境,高PPC对后期生精囊的发育依然有显著不良影响,并对家蚕生殖腺具有毒性累积和毒性滞后效应。致病机制研究结果显示,高PPC抑制了FB中卵黄蛋白原(Vg)的合成,并通过降低20-羟基蜕皮酮受体Ec R和E74信号作用途径,阻碍了Vg的转运;同时高PPC诱导了雌性卵巢组织的细胞自噬和凋亡作用,降低了Vg受体Vg R的表达,阻碍了卵黄蛋白的吸收,进而影响了卵巢的发育。