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[目的]多发性骨髓瘤是恶性血液肿瘤的常见疾病,它的发病率在血液恶性肿瘤中位居第二。虽然随着新药的不断问世,治疗策略也逐步优化,但它仍然是一种不可治愈的疾病。已有研究表明microRNA的失调可以导致染色体数量的改变、染色体易位、基因突变以及转录异常,对多发性骨髓瘤的发生发展均起到了重要的作用。这可能与microRNA的失调改变了下游靶基因信使RNA的转录水平和信号通路有关。miR-21在多发性骨髓瘤中常常呈现高表达状态,而且它涉及了调控细胞增殖、细胞凋亡、侵袭甚至耐药的功能。我们的前期研究发现,FOXO1在诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖中发挥着重要的作用。本研究利用数据挖掘技术分析在多发性骨髓瘤中与FOXO1基因相互作用的基因,探讨FOXO1与多发性骨髓瘤生存时间的关联。同时,进一步探索miR-21介导PTEN/AKT/FOXO1信号通路调控多发性骨髓瘤U266细胞株的分子机制。[方法]1.利用Oncomine数据库分析FOXO1基因在多发性骨髓瘤中mRNA水平的变化。通过BIOGPS分析人体正常组织和其相应的肿瘤组织中FOXO1基因的表达差异。2.利用GEPIA做FOXO1基因的表达水平与多发性骨髓瘤患者生存期的相关性分析。在String-DB数据库中探索FOXO1基因在细胞信号转导通路中的位置以及与其关系密切的上下游基因。3.qRT-PCR法检测miR-21在多发性骨髓瘤各细胞株中的表达水平,筛选miR-21高表达的细胞株。4.将miR-21抑制物及其阴性对照物转染至高表达miR-21的U266细胞株,构建转染株细胞,qPCR法检测转染前后U266细胞miR-21表达水平的变化。5.CCK-8法检测miR-21对U266细胞增殖的影响,流式细胞分析miR-21对U266细胞凋亡的作用,Western blot技术检测U266细胞转染miR-21前后PETN及FOXO1蛋白水平表达的变化。6.CCK-8法检测不同浓度藤黄酸对U266细胞增殖的影响,流式细胞分析藤黄酸对不同miR-21表达水平U266细胞凋亡的作用,Western blot分别检测加药组及未加药组U266细胞中PETN、AKT、pAKT-S308、FOXO1及Bim蛋白表达水平变化。[结果]1.Oncomine数据库和BIOGPS数据库分析结果显示,与正常组织相比,多发性骨髓瘤细胞中FOXO1在mRNA水平及蛋白水平均呈低表达状态。2.GEPIA检索发现FOXO1基因的表达水平与骨髓瘤患者的总体生存时间无明显相关性(LogrankP=0.39)。利用String-DB数据库分析证实PTEN、AKT基因与FOXO1有潜在的相互作用,PTEN基因可能通过AKT调控FOXO1的表达水平。3.qRT-PCR检测U266、MM.1S、RPMI8226、NCI-H929、IM-9骨髓瘤细胞株中miR-21表达水平,选取相对表达量最高的U266细胞株(85.68 8.1)倍(P<0.01)作为研究对象。4.qRT-PCR检测转染后U266细胞中miR-21表达水平,结果显示转染miR-21抑制物实验组U266细胞中miR-21相对表达水平显著低于转染抑制物阴性对照组(0.30 0.005 vs0.97 0.06,P<0.001)。5.转染miR-21抑制物后48小时,实验组U266细胞、阴性对照组U266细胞、空白对照组U266细胞增殖率分别为[(23.15 0.77)%、(95.89 0.07)%vs(99.03 0.71)],其差异具有统计学意义(P<0.05)。流式分析显示实验组U266细胞较阴性对照组细胞的凋亡明显增加[(10.36 1.23)%vs(3.39 0.63)%],差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示抑制了miR-21的表达,实验组与阴性对照组、空白对照组相比,U266细胞的PTEN、FOXO1蛋白表达水平均上调(P<0.05)。6.不同浓度的藤黄酸在作用了24h、48h、72h后均可抑制U266细胞增殖,细胞增殖抑制率呈药物浓度和时间的依赖性。流式细胞结果显示转染miR-21抑制物的U266细胞株,经藤黄酸处理后呈现更高的细胞凋亡率[(16.64 0.63)%vs(10.36 1.23)%],差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测表明藤黄酸能够有效抑制AKT的磷酸化,下调pAKT-S308蛋白表达水平,诱导FOXO1、Bim蛋白表达的增加(P<0.05)。[结论]1.生物信息网络技术发现FOXO1与多发性骨髓瘤的发生可能存在密切的关联。利用String-DB进一步分析证实PTEN基因能通过AKT调控FOXO1的表达水平,为探索FOXO1在骨髓瘤发生发展中的作用提供科学的理论基础。2.靶向抑制miR-21可以促进多发性骨髓瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖,这种作用可能是通过上调PTEN表达,下调AKT的磷酸化水平,促进FOXO1的表达来实现的,提示PTEN/AKT/FOXO1信号通路在miR-21调控多发性骨髓瘤的生物学行为中起到了相应的作用。3.藤黄酸可以通过介导AKT/FOXO1/BIM信号通路诱导高表达miR-21多发性骨髓瘤细胞的凋亡。下调miR-21的表达联合藤黄酸给药可以进一步促进U266细胞的凋亡,两者能够协同发挥抗肿瘤的作用。