N-糖基化作为蛋白质重要的翻译后修饰之一,广泛参与包括增殖生长、信号传导、免疫调节和炎症反应等重要生理活动。N-聚糖的定性和定量分析是蛋白质N-糖基化研究的重要组成部分。然而,研究表明N-聚糖具有微观不均一性、结构多样性以及动态变化等特性,不利于直接进行分析研究,因此需要有效的样品前处理方法将N-糖基化样品高效的、特异性的释放分离和富集标记。研究报道,诸多具有特殊功能的蛋白质可以有效应用于聚糖的释放分离和富集标记研究。本文旨在对这些具有特殊功能的蛋白质进行改造,使其更有效的用于蛋白质N-糖基化研究,具体工作如下:肽N-糖苷酶F（Peptide N-glycosidase F,PNGase F）是糖组学研究中重要的工具酶,它可以在温和条件下,专一性地释放完整的N-聚糖,在N-聚糖的结构和功能分析等研究中起到重要作用。目前His-PNGase F的生产常利用其可溶性的重组蛋白来进行纯化,但His-PNGase F在表达过程易形成无活性的包涵体蛋白,导致其生产成本相对较高。为有效利用包涵体形式的His-PNGase F,我们通过优化诱导条件,获得占菌液蛋白总量40%以上的重组His-PNGase F包涵体蛋白,再采用尿素变性和复性的方法,从而得到大量表达的目的蛋白。此外,实验证明末端引入共融合谷氨酰胺标签（Gln-substrate peptide tag,Q tag）,可有效提高可溶性PNGase F表达量,利于目的蛋白的直接纯化,也可提高PNGase F的产量。两种表达及纯化方案均可获得纯度>95%的目的蛋白,均具有较大的应用前景。酶固定化方法是提高PNGase F的使用效率的重要手段之一。本文对以上表达得到的带有两种不同分子标签的PNGase F的固定化进行研究。利用化学缩合和亲和相互作用的方法对His-PNGase F进行非定向和定向的固定化研究,得到非共价定向固定化方法相较于共价非定向化方法可提高约120倍的His-PNGase F负载量,且非共价定向固定化的His-PNGase F能够在重复使用五次后仍保留52.8%酶活性。该酶活性降低的部分原因是非共价定向固定化的PNGase F在使用过程中会发生流失。而Q tag在转氨酶的催化作用下能够介导PNGase F的共价定向固定化,共价定向固定化的PNGase F在重复使用五次后仍可具有78.6%的酶活性,显示融合Q tag的PNGase F在定向固定化中的应用优势。为了进一步提高固定化PNGase F的酶切效率,我们首次提出固定化PNGase F与微波辅助酶切相结合的方法,可有效地在5 min内实现N-聚糖的完全释放。PNGase F的定点突变和晶体结构分析验证其活性中心由D60N、E206和E118三个关键的氨基酸残基组成,其关键氨基酸位点的突变可导致水解活性丧失或改变与底物的亲和力。在前期研究的基础上,我们选择三种无水解酶活性的PNGase F突变蛋白进行分子改造和蛋白纯化,并用于聚糖的特异性识别。结果表明,R911突变型蛋白识别底物的能力相对较强,可以分别从混合样品中富集部分糖蛋白或糖肽而对非糖蛋白或非糖肽没有识别作用。然而,R911蛋白质结合底物的能力较弱,难以应用于大规模N-聚糖的分析。我们对另一种糖结合蛋白-识别糖链的F-box突变蛋白（a mutant of F-box that recognizes sugar chains,Fg）进行N-聚糖识别能力的分析,并首次验证N-聚糖的核心五糖结构对于Fg识别的必要性。融合谷胱甘肽硫转移酶标签的Fg（GST-tagged Fg,GFg）在温和的条件下能直接固定于谷胱甘肽修饰的琼脂糖微球,形成固定化的GFg-琼脂糖微球,可从免疫球蛋白G（Ig G）和辣根过氧化物酶（HRP）的酶切产物中分别鉴定到17条和11条糖肽,且在复杂的样品体系中表现出良好选择性和抗干扰性,利于糖肽的分析和检测。此外,GFg-琼脂糖微球用于蛋白质混合物的样品中,可以分离富集含有高甘露糖型聚糖的核糖核酸酶B（RNase B）和含有唾液酸型聚糖的转铁蛋白（transferrin）,有效地去除非糖蛋白的干扰。实验结果表明GFg-琼脂糖微球能有效分离富集N-糖基化样品,且具有成本低廉、操作简单和生物相容性好等优点,有望高通量和自动化的应用于糖肽或糖蛋白分析。基于Fg对N-聚糖的识别能力,我们设计融合绿色荧光蛋白（GFP）和Fg蛋白质的荧光探针（GFP-Fg）,对细胞膜上N-聚糖进行标记研究。共聚焦荧光成像技术和流式分析结果表明GFP-Fg可对细胞的N-聚糖实现特异性标记,且标记效率达到99.9%。这种特异性的荧光探针为细胞膜上N-聚糖的分析提供了新的研究手段。综上所述,基于PNGase F和Fg的结构和功能,两类蛋白质可有效应用于N-聚糖的分离、富集和标记研究。结果表明,定向固定化的PNGase F展现出良好的酶活性和重复使用性,为高通量的N-聚糖的研究提供了新的技术手段。同时,改造后的PNGase F和Fg蛋白质可特异性应用于N-聚糖的识别和富集研究,并且能够进一步应用于细胞表面N-聚糖的标记。两类功能蛋白的相关研究为蛋白质N-糖基化的研究提供新的手段,具有广阔的应用前景。