研究背景与目的恶性淋巴瘤是一组源于血液淋巴系统的恶性肿瘤,在我国其发病率约为男性1.39/10万,女性0.84/10万,但近些年发病呈上升趋势。霍奇金病治疗效果较好,主要采用联合化疗并结合放疗。非霍奇金淋巴瘤治疗以联合化疗为主,但常规治疗易复发,挽救性治疗效果差,并且化疗药物毒副作用大。生物免疫治疗被认为是继手术、放疗、化疗之后,对肿瘤具有确切效果的又一治疗方法。目前免疫治疗包括干扰素、细胞因子、单克隆抗体、肿瘤疫苗、免疫基因治疗、过继性免疫治疗等。过继性免疫治疗(ATI)是指通过向肿瘤患者传输具有抗肿瘤活性的免疫细胞,直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫效应,从而达到治疗肿瘤的目的。目前普遍认为CIK、NK细胞及肿瘤抗原特异性CTL都是较为理想的免疫效应细胞。IL-15有广泛的生物学效应：能激活NK细胞和T细胞,诱导这些免疫细胞对肿瘤的杀伤活性；能促进NK细胞和T细胞的溶细胞作用；具有T细胞趋化作用；能对NK细胞和T细胞的分化起特异性的支持作用。NK细胞和T细胞作为体内主要杀伤肿瘤细胞的免疫细胞,特别是T细胞识别肿瘤抗原后对肿瘤细胞的特异性杀伤是免疫治疗的中心环节。免疫细胞杀伤肿瘤必须具备两个条件：1、肿瘤细胞能激活免疫细胞；2、被激活的免疫细胞能够杀害肿瘤细胞。目前免疫细胞存在以下问题：免疫细胞激活不够,肿瘤细胞产生杀伤抵抗。近年研究表明,射线、蒽环类化疗药物可诱导肿瘤细胞出现早期凋亡,导致促凋亡的钙网蛋白(calreticulin, CRT)从细胞的胞质转位到胞膜,从而易被树突状细胞表面的受体识别、吞噬,继而将肿瘤抗原加工、呈递给T细胞,激发机体的抗肿瘤免疫应答。本研究旨在观察X射线是否可以诱导Burkitt淋巴瘤Raji细胞凋亡,将照射后的Raji细胞作为免疫刺激物联合rhIL-15(重组人白细胞介素-15)是否可以增强人同种异体外周血单个核细胞(allogeneic human peripheral blood mononuclear cells, allo-PBMCs)的杀伤活性。实验方法第一部分X射线诱导人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji凋亡Varian医用直线加速器常温下照射,照射距离为100cm,剂量率100cGy/min,照射野为30cm×20cm,照射剂量分别为0、4、8、12、16Gy,0Gy组作为正常对照。照射后Raji细胞继续于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,分别于第12、24、48h收集细胞进行检测。采用倒置相差显微镜观察Raji细胞照射后的形态学改变；台盼蓝拒染法计算照射后细胞活细胞数及抑制率；流式细胞仪测定照射后细胞凋亡率、细胞周期；以甲基纤维素半固体培养法测定照射后Raji细胞体外克隆形成能力。第二部分X射线照射后的淋巴瘤细胞联合rhIL-15对allo-PBMCs杀伤活性的影响密度离心法分离健康志愿者外周血50m1,获得外周血单个核细胞(PBMCs)。收集X射线照射8Gy,48h后的Raji细胞,以细胞数比例1：20加入allo-PBMCs悬液中,设4组：正常对照组(PBMCs)、rhIL-15+PBMCs组、照射细胞+PBMCs组、rhIL-15+照射细胞+PBMCs组。培养第3天,ELISA试剂盒测定IFN-y分泌水平。培养第14天,显微镜下计数allo-PBMCs数量；LDH释放法测定培养后allo-PBMCs对Raji细胞的杀伤活性,K562、KGla细胞株作为靶细胞对照；观察活化的allo-PBMCs与Raji细胞共培养后Raji细胞体外克隆形成情况；流式细胞仪测定allo-PBMCs表面NKG2D受体的表达水平。统计学方法应用SPSS13.0软件处理数据,实验资料结果用均数±标准差(x±s)表示,检验水准P<0.05,有显著性差异或差异有统计学意义。采用两样本t检验,方差不齐时采用satterthwaite近似t检验；单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐时,组间多重比较采用LSD法、SNK法,方差不齐时,组间多重比较采用DunnettT3;析因设计方差分析,组间多重比较采用SNK法。结果第一部分X射线诱导人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji凋亡①通过比较X射线照射后12、24、48h的活细胞数和生长抑制率,发现照射后Raji细胞数量与初始铺板1.5×105相比不再增加。不同照射剂量组间活细胞数有显著差异(F=244.597,P<0.001),16Gy组活细胞数显著低于正常对照组；照射后不同时间之间有显著差异(F=36.345,P<0.001)；不同照射剂量与时间存在交互效应,具有统计学意义(F=79.614,P<0.001)。比较同一时间点(12、24、48h),不同照射剂量组(0、4、8、12、16Gy)间的活细胞数有无差异：24、48h两个时间点不同剂量组活细胞数差异有统计学意义(F=51.138,P<0.001和F=322.936,P<0.001),同一时间,随照射剂量增加,活细胞数基本逐渐减少；比较同一剂量组在不同时间点的活细胞数量有无差异：各照射剂量组(4、8、12、16Gy)的活细胞数在不同时间差异有统计学意义(P<0.001、P=0.094和P=0.007、P<0.001),同一照射剂量,随时间增加,活细胞数逐渐减少。比较不同的时间点(12、24、48h),不同照射剂量组(4、8、12、16Gy)间的细胞抑制率有无差异(由于细胞生长抑制率以正常组作为对照,故正常对照组抑制率为0,不纳入统计组别)：不同照射剂量组间有显著差异(F=14.647,P<0.001),16Gy组抑制率显著高于其他组；照射后不同时间之间有显著差异(F=108.916,P<0.001),48h组抑制率显著高于其他组；不同照射剂量与时间不存在交互效应(P>0.05)。24、48h两个时间点不同剂量组抑制率差异有统计学意义(P=0.003、P=0.001),24、48h,随照射剂量增加,抑制率逐渐增大；各照射剂量组(4、8、12、16Gy)的细胞抑制率在不同时间点差异有统计学意义(P<0.001、P=0.001和P=0.001、P=0.023),同一剂量率,随时间增加,抑制率逐渐增大。结果提示：X射线可抑制Raji细胞的增殖,对Raji细胞的生长抑制率呈剂量、时间依赖性。②倒置显微镜观察X射线照射后Raji细胞形态,正常对照组Raji细胞呈圆形聚团生长,大小均一,折光性好,透亮,边缘清楚。照射后Raji细胞生长状态变差,部分细胞出现皱缩、胞体变小或变大,细胞碎片增多,折光性减弱,胞质中出现空泡。8、16Gy组48h Raji细胞与正常对照组相比,8Gy组细胞出现皱缩,胞体变小,细胞碎片增多,折光性弱,16Gy组细胞碎片更多、胞体变大、折光性更弱。③采用流式细胞仪检测Raji细胞凋亡率,比较在不同时间点(12、24、48h),不同照射剂量组(0、4、8、12、16Gy)Raji细胞早期凋亡率有无差异：不同照射剂量组间有显著差异(F=21.195,P<0.001),8Gy、12Gy组早期凋亡率高于其他组,这两组间无显著差异；照射后不同时间之间有显著差异(F=77.206,P<0.001),48h组显著高于其他两组,其他两组间无显著差异；不同照射剂量与时间存在交互效应(F=11.471,P<0,001)。48h,不同剂量组细胞早期凋亡率差异有统计学意义(F=28.408,P<0.001),经SNK多重比较,4、8、12、16Gy组早期凋亡率均大于0Gy正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),8Gy组48h细胞早期凋亡率为(42.04±3.62)%,明显大于48h其他组,差异有统计学意义(P<0.05)。比较在不同时间点(12、24、48h),不同照射剂量组(0、4、8、12、16Gy)Raji细胞晚期凋亡、坏死率有无差异：不同照射剂量组间有显著差异(F=30.060,P<0.001),16Gy组显著高于其他组(P<0.05),8、12、16Gy组显著高于对照组,对照组、4Gy组间无显著差异；照射后不同时间之间有显著差异(F=58.892,P<0.001),48h组显著高于其他两组；不同照射剂量与时间存在交互效应(F=9.919,P<0.001)。24、48h两个时间点,不同剂量组差异有统计学意义(F=14.338,P<0.001和F=22.986,P<0.001),经SNK多重比较,48h,8、12、16Gy组明显大于48h其他组,差异有统计学意义(P<0.05)。24h,8、16Gy组大于其他组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示：X射线照射后Raji细胞早期凋亡率可达(42.04±3.62)%,凋亡率随时间延长和照射剂量增大基本呈上升趋势。④Raji细胞经X射线照射后发生了细胞周期的改变,流式细胞仪测定诱导早期凋亡率最高的8Gy组细胞周期,0、12Gy组作为对照。比较照射后24h不同时期(G0/G1、S、G2/M),不同剂量组(0、8、12Gy)的细胞百分比有无差异：照射后24h,G0/G1、S、G2/M各期中不同剂量组细胞百分比差异有统计学意义(F=11.875,P=0.008、F=22.752,P=0.002、F=60.899,P<0.001),经SNK多重比较,G2/M期8、12Gy组百分比明显大于0Gy组,差异有统计学意义(P<0.05),8Gy组与12Gy组G2/M期细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)；S期,8Gy组百分比,明显小于0Gy组,差异有统计学意义(P<0.05)。说明X射线8Gy照射后Raji细胞周期阻滞在G2/M期。⑤观察X射线对Raji细胞体外克隆形成的影响,照射后第7、14天,倒置显微镜下观察并计数细胞克隆形成数,以>50个细胞的细胞团为1个细胞克隆。不同照射剂量组(0、8Gy)间有显著差异(F=169.535,P<0.001),8Gy组显著低于对照组；照射后不同时间之间有显著差异(F=27.903,P=0.001),第14天克隆数显著高于第7天；不同照射剂量与时间存在交互效应(F=24.125,P=0.001)。同一时间点,0、8Gy组克隆形成数差异有统计学意义(F=33.108,P=0.005和F=159.668,P<0.001)。结果提示：X射线对Raji细胞生长有明显抑制作用,但8Gy照射后第14天仍有细胞克隆生长,说明X射线8Gy照射后并不能完全抑制Raji细胞的生长增殖。第二部分X射线照射后的淋巴瘤细胞联合rhIL-15对allo-PBMCs杀伤活性的影响①探索Raji细胞与allo-PBMCs共培养效靶比,培养第3天,显微镜下观察细胞形态,效靶比1：1、1：5、1：10组allo-PBMCs状态变差,大部分细胞胞体变大,细胞膜不完整,折光性减弱,胞质中出现空泡,细胞碎片增多；正常对照组细胞仍悬浮散在生长,细胞状态良好;1：20、1：40组出现allo-PBMCs聚团生长,胞体圆形透亮,仍可见散在照射后Raji细胞；培养第6-9天,效靶比1：1、1：5、1：10组allo-PBMCs基本死亡,细胞破裂；正常对照组细胞仍悬浮散在生长,细胞状态良好；1：20、1：40组可见allo-PBMCs聚团生长,细胞团较前变大,胞体圆形透亮,可见很少量散在照射后Raji细胞及碎片；培养第12-14天,效靶比1：1、1：5、1：10组allo-PBMCs死亡；正常对照组细胞仍悬浮散在生长,细胞状态良好；1：20、1：40组allo-PBMCs仍聚团生长,细胞团较前增多、变大,胞体圆形透亮,照射后Raji细胞基本消失。第14天计数各组allo-PBMCs (由于效靶比1：1、1：5、1：10时,allo-PBMCs均死亡,故不纳入统计),各组allo-PBMCs数量差异无统计学意义(P>0.05)。结果提示：X射线照射后Raji细胞与allo-PBMCs共培养后,可诱导allo-PBMCs的凋亡,在1：20、1：40培养体系中,allo-PBMCs可围绕照射后细胞聚团生长,但allo-PBMCs并无明显增殖。②观察照射后细胞联合rhIL-15对allo-PBMCs生长增殖的影响,照射后细胞联合rhIL-15与allo-PBMCs共培养后(1：20),第14天计数各组allo-PBMCs数量。各组allo-PBMCs数量差异有统计学意义(F=30.176,P<0.001),经SNK多重比较,rhIL-15+PBMCs组、rhIL-15+照射细胞+PBMCs组allo-PBMCs数量高于其余两组,差异有统计学意义(P<0.05),且rhIL-15+PBMCs组高于rhIL-15+照射细胞+PBMCs组,差异有统计学意义(P<0.05)。③ELISA试剂盒检测IFN-γ分泌水平,各组(正常对照组、rhIL-15+PBMCs组、照射细胞+PBMCs组、rhIL-15+照射细胞+PBMCs组)培养第3天上清IFN-y浓度差异有统计学意义(F=17.803,P=0.001),经SNK多重比较,rhIL-15+PBMCs组、rhIL-15+照射细胞+PBMCs组IFN-y浓度高于正常对照、照射细胞+PBMCs组,差异有统计学意义(P<0.05),rhIL-15+PBMCs组、rhIL-15+照射细胞+PBMCs组IFN-y浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果提示：rhIL-15可促进PBMCs分泌IFN-y,而照射后细胞联合rhIL-15与rhIL-15相比并不能明显提高IFN-y的分泌。④效靶比10：1时,各组allo-PBMCs对肿瘤细胞的杀伤活性有显著性差异(F=21.138,P<0.001),rhIL-15+PBMCs组、rhIL-15+照射细胞+PBMCs组的杀伤活性大于其他两组(P<0.05)。三种肿瘤细胞(Raji、KGla、K562)被allo-PBMCs杀伤的水平有显著性差异(F=9.238,P=0.001),K562细胞被杀伤的水平大于Raji、KGla细胞(P<0.05)。allo-PBMCs的杀伤活性与细胞之间有交互效应(F=4.438,P=0.004)。各组allo-PBMCs对Raji细胞的杀伤活性差异无统计学意义(P>0.05),经SNK多重比较,rhIL-15+照射细胞+PBMCs组对Raji细胞的杀伤活性(28.97±4.17)%较正常组增强,差异有统计学意义(P<0.05),但与rhIL-15+照射细胞+PBMCs组对KGla杀伤活性相比,差异无统计学意义(P>0.05)；结果提示：效靶比10：1时,照射后细胞联合rhIL-15能提高allo-PBMCs对Raji细胞的杀伤活性。效靶比20：1时,各组allo-PBMCs对细胞的杀伤活性有显著性差异(F=59.299,P<0.001),rhIL-15+PBMCs组、rhIL-15+照射细胞+PBMCs组的杀伤活性大于其他两组(P<0.05)。三种肿瘤细胞(Raji/、KGla、K562)被allo-PBMCs杀伤的水平有显著性差异(F=54.183,P<0.001),K562细胞被杀伤的水平大于Raji、KGla细胞(P<0.05)。allo-PBMCs的杀伤活性与细胞之间有交互效应(F=21.074,P<0.001)。经SNK多重比较,rhIL-15+照射细胞+PBMCs组、rhIL-15+PBMCs组allo-PBMCs对Raji细胞的杀伤活性大于其他两组(P<0.05),且rhIL-15+照射细胞+PBMCs组杀伤活性大于rhIL-15+PBMCs组(P<0.05)；rhIL-15+照射细胞+PBMCs组allo-PBMCs对Raji、K562细胞杀伤活性大于KGla细胞(P<0.05)。结果提示：rhIL-15能提高allo-PBMCs对肿瘤细胞的杀伤活性。照射后细胞联合rhIL-15可协同提高allo-PBMCs对Raji细胞的杀伤活性,与KGla细胞相比,可提高对Raji细胞的特异性杀伤。⑤观察活化的allo-PBMCs与Raji细胞共培养后Raji细胞体外克隆的形成情况,共培养后第7、14天,倒置显微镜下观察并计数细胞克隆形成数,以>50个细胞的细胞团为1个细胞克隆。不同效应细胞组间有显著差异(F=20.681,P<0.001),经SNK多重比较,未加入allo-PBMCs的Raji细胞组显著高于其他组,rhIL-15+照射细胞+PBMCs组克隆数显著低于其他组(P<0.05)；不同时间之间有显著差异(F=244.358,P<0.001),第14天克隆数显著高于第7天；不同效应细胞组与时间无交互效应(F=1.018,P=0.422)。同一时间点,各组克隆形成数差异有统计学意义(F=27.938,P=0.005和F=12.763,P<0.001),rhIL-15+PBMCs组、rhIL-15+照射细胞+PBMCs组均显著大于王常对照组(P<0.05),但两组间无显著差异(P>0.05)。说明rhIL-15联合照射后细胞活化后的allo-PBMCs只能轻度抑制Raji细胞的克隆形成,随着培养时间延长,这种抑制效应逐渐减小。与单纯rhIL-15活化相比,并不能明显提高allo-PBMCs对Raji细胞克隆形成的抑制。⑥正常对照组、rhIL-15+PBMCs组、照射细胞+PBMCs组、rhIL-15+照射细胞+PBMCs组PBMCs表达NKG2D水平差异有统计学意义(P<0.001),rhIL-15+PBMCs组表达显著高于其他组,正常对照组、照射细胞+PBMCs组间表达无显著差异(P>0.05)。结果提示：rhIL-15可诱导PBMCs表面NKG2D受体的表达,但rhIL-15联合照射后细胞与allo-PBMCs共培养后,与单纯加入rhIL-15相比,NKG2D受体表达反而减少。结论1.X射线可抑制Raji细胞增殖,并诱导细胞凋亡,抑制率和凋亡率随时间延长和照射剂量增大基本呈上升趋势；8Gy照射后Raji细胞早期凋亡率可达(42.04±3.62)%,细胞周期阻滞在G2/M期；X射线8Gy并不能完全抑制肿瘤细胞的生长增殖。2.根据对早期凋亡率的测定,可选择X射线8Gy照射后48h Raji细胞作为免疫刺激物活化allo-PBMCs。3.X射线照射后细胞联合rhIL-15可协同提高allo-PBMCs对Raji细胞的杀伤活性,与KG1a细胞相比,可提高对Raji细胞的特异性杀伤。RhIL-15联合照射后细胞活化后的allo-PBMCs只能轻度抑制Raji细胞的克隆形成,随着培养时间延长,这种抑制效应逐渐减小。与单纯rhIL-15活化相比,并不能明显提高allo-PBMCs对Raji细胞克隆形成的抑制。4. RhIL-15可促进PBMCs分泌IFN-y,并诱导NKG2D受体的表达,而照射后细胞联合rhIL-15与单纯加入rhIL-15相比,并不能明显提高IFN-y的分泌,allo-PBMCs表面NKG2D受体表达反而减少。本研究的创新点：1、探索X射线照射后的Raji细胞早期凋亡率最高的照射剂量和培养时间,在单次照射8Gy后,Raji细胞的生长和增殖并不能完全被抑制。2、通过联合X射线照射后Raji细胞和rhIL-15与allo-PBMCs共同培养,提高allo-PBMCs对Raji细胞的杀伤活性,为淋巴瘤的细胞治疗提供新的研究思路。本研究的价值：X射线8Gy照射后,Raji细胞早期凋亡率可达(42.04±3.62)%,但并不能完全抑制Raji细胞的生长增殖。X射线照射后Raji细胞联合rhIL-15可以协同提高allo-PBMCs对淋巴瘤Raji细胞的特异性杀伤,寻求了一种新的细胞治疗方法。