【背景】腹膜透析(peritoneal dialysis)因其操作简单,价格低廉被认为是终末期肾病(End-stage renal disease, ESDR)可供选择的一种肾脏替代治疗方式。但是长期腹膜透析可以引起腹膜结构和功能的改变,腹膜发生纤维化,最终导致腹膜衰竭、超滤失败,病人不得不退出腹膜透析。在这个过程中腹膜完整性的维持是腹膜透析病人最大的挑战,而且近几年来本领域的研究热点和焦点是腹膜透析引起腹膜纤维化的分子机制。2003年Yanez等首次证实腹膜间皮细胞向间充质转分化(Epithelial-to-masenchymal transition,EMT)是腹膜纤维化的重要分子机制之一。虽然已有研究证实Notch1、snail、NF-κB等分子参与了腹膜透析引起的腹膜间皮细胞的转分化,但是单纯高糖引起腹膜间皮细胞转分化的分子机制仍不明。Twist蛋白是碱性螺旋-环-螺旋结构(basic helix-loop-helix, BHLH)家族中进化上高度保守的一个转录因子,在胚胎发育、肿瘤细胞的侵袭、转移等方面发挥着重要的作用。然而在腹膜间皮细胞转分化的过程中,Twist是否也发挥着重要的作用,目前仍未见报道。因此,深入研究在高糖刺激下腹膜间皮细胞转分化的分子机制,可为临床有效的防治腹膜纤维化提供新的理论依据。【目的】1.探讨Twist在高糖刺激的人腹膜间皮细胞转分化中的作用。2.在高糖透析液引起的大鼠腹膜纤维化模型中Twist的表达。【方法】1.用不同浓度的葡萄糖刺激人腹膜间皮细胞检测Twist的表达,筛选出最佳的高糖浓度。2.用筛选出的高糖浓度、不同时间处理人腹膜间皮细胞,从蛋白水平及mRNA水平检测Twist的表达情况。3.用筛选出的高糖浓度处理人腹膜间皮细胞48小时,分别用免疫荧光、Western blotting法检测Twist、E-cadherin、α-SMA的表达。4.人腹膜间皮细胞系转染上调质粒pcDNA3.1-Twist和空载体pcDNA3.1后,用Western blot、qRT-PCR方法检测Twist、E-cadherin、α-SMA的表达情况。5. Western blot方法检测转分化的人腹膜间皮细胞转染下调质粒Si-Twist后,Twist、E-cadherin、α-SMA的表达情况。6.采用4.25%的高糖腹膜透析液腹腔灌注建立大鼠腹膜纤维化模型,造模成功后,HE染色法检测腹膜的厚度,免疫组织化学检测Twist、E-cadherin、α-SMA的表达。7.裂解腹膜纤维化的大鼠腹膜与对照组腹膜收蛋白,Western blot法检测Twist的表达。【结果】1.用30、40、50、60、120mmol/L的不同葡萄糖浓度刺激人腹膜间皮细胞与对照组(5.6mmol/L)相比,Twist表达明显增加,且在50mmol/L表达最强。所以本课题的高糖浓度就确定为50mmol/L。2.人腹膜间皮细胞经高糖刺激不同时间后,Twist蛋白水平及mRNA水平均明显增高,且具有时间依赖性,在48小时达高峰。3. Western blot和免疫细胞化学显示:与对照组相比,高糖组Twist表达显著增高,且与α-SMA呈正相关,与E-cadherin呈负相关,(P<0.05)。4. Western blot、qRT-PCR结果表明:正常人腹膜间皮细胞在过表达Twist后,E-cadherin表达减弱,α-SMA表达增加,(P<0.05)。5.转分化的人腹膜间皮细胞转染Si-Twist,Twist表达下降后,E-cadherin表达增强,α-SMA表达减弱,(P<0.05)。6.腹膜纤维化模型中,HE染色腹膜厚度较对照组明显增厚,(P<0.05);免疫组化显示,腹膜纤维化组与对照组相比,Twist表达增加,E-cadherin表达减弱、α-SMA表达增强,(P<0.05)。7.与对照组比,高糖透析液腹腔灌注腹膜纤维化模型中,Twist表达明显增强(P<0.05)。【结论】1.在高糖的刺激下,Twist表达增强,且与间充质细胞特异性蛋白α-SMA呈正相关,与上皮细胞特异性分子E-cadherin呈负相关,提示Twist可能参与高糖刺激下人腹膜间皮细胞的转分化。正常人腹膜间皮细胞在过表达Twist后,E-cadherin表达减弱,α-SMA表达增加;转分化的人腹膜间皮细胞转染Si-Twist,Twist表达下降, E-cadherin表达增强,α-SMA表达减弱,提示Twist可能在人腹膜间皮细胞的EMT中发挥着重要的作用。2.与对照组相比,在SD大鼠的腹膜纤维化模型中,Twist表达明显增强,与E-cadherin呈负相关,与α-SMA正相关。体内体外试验证实:在高糖诱导下,Twist在人腹膜间皮细胞的转分化中发挥着重要的作用。