膀胱癌位列男性最常见实体瘤的第五位，是发病率第二位的泌尿系统肿瘤，在女性位列第七位，每年全世界新发膀胱癌病例386300例，死亡150200例，表观遗传学变异是癌症发生除基因突变外的另一个主要因素，研究表明，抑癌基因的甲基化变异作为主要的表观遗传学改变可以作为膀胱癌诊断、治疗和预后的靶点。本研究利用收集的112例临床膀胱癌肿瘤组织样本、尿液样本、外周血循环DNA，利用MSP方法进行抑癌基因甲基化谱系的筛查，并成功建立了四种抑癌基因建立的甲基化筛查体系，展示了一定的应用前景，同时我们还针对膀胱肿瘤甲基化变异的特点，进行了普鲁卡因和PA-MSHA抗膀胱癌肿瘤细胞增值机制的探讨。1膀胱癌肿瘤组织的抑癌基因甲基化状态分析1.1 8种抑癌基因在膀胱癌肿瘤组织的抑癌基因甲基化状态分析我们首先利用MSP方法分析了实体肿瘤组织中的抑癌基因P14ARF，RUNX3，DAPK，E-cad，ITGA4，RARβ，HPP1，APAF1 8种抑癌基因的甲基化状态，结果显示：P14ARF甲基化阳性率为26.7%；RUNX3甲基化阳性率为56.2%；DAPK甲基化阳性率为29.4%；E-cad甲基化阳性率为11.6 %；ITGA4甲基化阳性率为75.0%；RARβ甲基化阳性率为91.0%；HPP1甲基化阳性率为48.2%；APAF1甲基化阳性率为90.1%；除ITGA4基因外，其他7对基因正常膀胱组织和腺性膀胱炎组织并没有差别（P>0.05），ITGA4基因正常膀胱组织和腺性膀胱炎组织有统计学差别（P=0.003）；除ITGA4基因和E-cad基因外（P=0.081，P=0.214），其他6种抑癌基因的膀胱癌组甲基化阳性率与对照和腺性膀胱炎组相比经χ2检验，P<0.05，均有统计学差异，该结果表明这6种抑癌基因可以作为膀胱癌组甲基化诊断的候选标志物。1.2膀胱癌肿瘤组织的抑癌基因甲基化状态与患者性别关系分析膀胱癌患者P14ARF甲基化阳性男性患者为30例，阴性为65例；17例女性患者中15例为甲基化阴性，2例甲基化阳性病例；二者阳性率比较有统计学意义；DAPK甲基化阳性男性患者为21例，阴性为74例；17例女性患者中4例为甲基化阴性，12例甲基化阳性病例；二者阳性率比较有统计学意义（P<0.001）；1.3膀胱癌肿瘤组织的抑癌基因甲基化状态与患者年龄关系分析8种抑癌基因患者年龄与甲基化发生之间没有关联关系，表明抑癌基因的甲基化可以发生在任何年龄段的膀胱癌患者；1.4膀胱癌肿瘤组织的抑癌基因甲基化状态与患者病理分级关系分析我们获得了患者的完整病理资料，将患者的抑癌基因甲基化状态和病理分级进行了归类整理，从中我们发现：在I期高表达的基因有RUNX3、DAPK、ITGA4、RARβ、APAF1，低表达的基因有P14ARF、E-cad、HPP1，之间各基因比较有统计学差异（p<0.05）；随着肿瘤分期增长，DAPK表达水平明显减弱，Ⅰ期与Ⅱ期相比有统计学差异（p=0.001）；1.5抑癌基因甲基化与浸润程度关联分析浸润程度是判断膀胱癌预后的一个重要指标，我们将8种抑癌基因甲基化的情况与膀胱癌浸润程度也进行了关联分析，结果显示，E-cad、RUNX3组非浸润组和浸润组之间阳性率有差异（p<0.01）；其余各基因组非浸润组和浸润组之间没有差异；在非浸润膀胱癌中，RUNX3、ITGA4、RARβ、APAF1甲基化阳性率明显高于其他4组基因，具有统计学意义（p<0.01）；1.6 MSP实验的敏感性研究:MSP实验的灵敏度很高，1 ng的甲基化DNA为模板，依然可以扩增出明显的特异性的片断，这说明MSP方法可以作为早期诊断筛查的手段。2膀胱癌尿沉渣细胞的抑癌基因甲基化状态分析我们利用MSP技术分析了尿沉渣细胞的甲基化状态，结果显示：P14ARF甲基化阳性率为20.5%（23/112）；RUNX3甲基化阳性率为56.25%（63/112）；DAPK甲基化阳性率为26.7%（30/112）；E-cad甲基化阳性率为1.7%（2/112）；ITGA4甲基化阳性率为69.6%（84/112）；RARβ甲基化阳性率为87.5%（98/112）；HPP1甲基化阳性率为27.6%（31/112）；APAF1甲基化阳性率为77.6%（100/112）；除E-cad基因腺性膀胱炎患者及膀胱癌患者检出率均很低，表明该基因不适合作为尿液检测的标志物，在膀胱癌患者尿沉渣细胞的MSP分析，整体趋势上同利用膀胱癌组织得出的结论是吻合的；3膀胱癌外周血循环DNA的抑癌基因甲基化状态分析3.1正常人与膀胱癌患者的外周血循环DNA含量的比较我们比较了健康献血者、腺性膀胱炎患者、和膀胱癌患者的血浆循环DNA产量，结果显示：健康献血者、腺性膀胱炎患者之间血浆循环DNA的产量没有明显的不同、而膀胱癌患者的血浆循环DNA产量明显高于健康献血者、腺性膀胱炎患者，具有统计学意义；3.2几种血浆循环DNA提取方法的比较我们进行了ZYMO公司ZR GENOMIC DNAⅡkit试剂盒和酚氯仿法及promega公司Wizard Genomic DNA Purification Kit的提取循环DNA的对比实验，结果如下：利用ZYMO公司ZR GENOMIC DNAⅡkit提取的效果最好，时间最短，循环DNA的产量可以增加30%，整个操作时间缩短为20 min；3.3膀胱癌患者外周血循环DNA抑癌基因的甲基化状态分析我们利用MSP方法分析了膀胱癌患者血浆循环DNA中的四种甲基化阳性频率最高的抑癌基因HPP1，ITGA4，RARβ，APAF1的甲基化状态，结果如下；这四种基因的甲基化变异程度整体上与肿瘤组织和尿沉渣细胞的结果是吻合的，然而其阳性率明显低于肿瘤组织和尿沉渣细胞，分别为HPP1（19.6%），ITGA4（29.4%），RARβ（44.6%），APAF1（30.3%）；4 PA-MSHA和Procaine对T24和5637膀胱癌细胞的抑制增生机制研究4.1 PA-MSHA和Procaine可以抑制T24和5637细胞增生，并诱导凋亡我们利用CCK-8法检测和Hoechst 33258荧光染色法证实，PA-MSHA（4 mmol/L）和Procaine（4×1011/L）抑制T24和5637膀胱癌细胞增殖呈剂量相关性，并能诱导细胞出现凋亡小体；4.2 Procaine可以抑制T24或5637细胞抑癌基因APAF1的甲基化状态Real-time MSP检测，结果显示，APAF1基因甲化率由普鲁卡因作用前的11.2%±0.26%；降低至作用后的6.4%±0.34%；而PA-MSHA对T24或5637细胞抑癌基因甲基化状态没有明显的作用；4.3 PA-MSHA与Procaine诱导的T24和5637膀胱癌细胞凋亡与Caspase-3/9及sFASL上调和活化，抑制MMP-9的表达相关采用分光光度法检测Caspase-3/9蛋白的表达含量在PA-MSHA与Procaine作用前后的变化情况，结果显示：Procaine和PA-MSHA能够活化T24细胞中Caspase最主要的效应蛋白—Caspase 3及Caspase 9；而普鲁卡因却不能活化5637细胞中的Caspase 3及Caspase 9蛋白，PA-MSHA可以活化Caspase 9蛋白。该结果表明，PA-MSHA和Procaine能够通过Caspase介导的细胞凋亡途径抑制膀胱癌细胞的生长，同时，其诱导凋亡机制与PA-MSHA和Procaine还能抑制MMP-9的表达和上调sFASL的活化有关。