细胞凋亡（Cell Apoptosis），是指一种受遗传控制的具有显著形态特征的细胞死亡，也称细胞程序性死亡（Program Cell Death，PCD）。细胞凋亡对机体的正常发育、维持正常生理功能有着重要意义，尤其是在个体发育、器官发育及病理发生等过程，如癌症，心血管疾病和自身免疫病等疾病过程中都发挥着重要作用。对于这些细胞凋亡相关基因的研究，可以深入地对骨骼肌发育及中外猪种肌肉发育及体型差异进行研究，进而对动物育种和人疾病模型的研究提供重要借鉴。　　 PPPDE1（PPPDE Peotidase Domain Containing 1，含PPPDE肽酶结构域蛋白1），是近年在人中新发现的一个编码凋亡前表达蛋白（Pro-apoptotic Protein）。在本室前期的研究中，该基因在猪骨骼肌发育中可能起着重要作用。本研究通过生物信息学方法对人PPPDE1的生物学特征进行预测，进而利用分子生物学和细胞生物学技术，从核酸及蛋白质两个水平上进行结构与细胞生物学功能研究，主要取得了如下研究结果：　　 1．推导的PPPDE1编码的蛋白质特点。　　 由人PPPDE1的CDS序列推导出人的PPPDE1编码着一个含有194个氨基酸残基，既无信号肽又无跨膜结构的非分泌性蛋白质；其内部含有一个功能未明确的DUF862保守结构域，该结构域从果蝇到哺乳动物广泛存在；同源比对分析发现该基因在哺乳动物之间同源性极高达96-99％，与家禽及斑马鱼分别有着94％和60％的相似性，甚至拟南芥的该蛋白质与人也有着45％的相似性。　　 2．PPPDE1基因的表达谱特征。　　 通过NCBI及UCSC网站上的EST序列及芯片特征，发现该基因在胚胎发育时期，癌组织及细胞中有较高表达，尤其是在胚胎发育早期、白血病相关细胞系及恶性肿瘤细胞系中。但在一些正常组织如卵巢、睾丸和膀胱等组织中表达量也很高。　　 3．PPPDE1基因保守区的定点诱变及载体构建。　　 根据已获得的该基因的遗传信息，采用大引物PCR法将其编码的第108位半胱氨酸诱变成丝氨酸。并分别成功构建了突变型与野生型的pGEX-6p1、pEGFP-N1及pcDNA3.1（+）过表达载体。　　 4．亚细胞定位。　　 利用绿色荧光表达载体pEGFP－N1与该基因编码框进行融合表达，转染．A549细胞并染色后通过荧光倒置显微镜进行观察，发现野生型的蛋白质可能分布于高尔基体，说明该蛋白质存在于高尔基体内并发挥其生物学功能，而突变型的表达分布则有着明显不同，可能分布于内质网中。　　 5．野生型及突变型的超表达。　　 将该基因编码框插入到真核超表达载体pcDNA3.1（+）中和细胞转染后，同时采用促凋亡药物卡铂处理，利用倒置显微镜在普通视野下观察发现，随着转染后时间的延长，越来越多的细胞出现萎缩，浓缩等凋亡现象；利用MTT试验检测，发现PPPDE1野生型基因在无促抗凋亡药物卡铂时，有促凋亡作用，而随着卡铂浓度的增高，其反而发生了拮抗现象；然而突变型无此显著现象。　　 6．PPPDE1基因的原核表达及纯化。　　 将该基因的突变型与野生型分别构建入pGEX-6p1载体后，按照常规的实验方法对该基因进行原核表达，可明显发现在约47kDa处有诱导表达产物条带。由于pGEX-6p1载体携带GST标签，原核表达产物为融合蛋白，而GST大小约26kda，即说明该基因编码蛋白大小约为21kda。经GSTrap柱一步法纯化后，得到了其纯化蛋白。　　 7．Pull-down实验。　　 在利用人肺腺癌细胞（A549 cells）获得人细胞蛋白粗提液后，利用GSTrap柱钓取互作蛋白，通过SDS－PAGE共检测出PPPDE1编码蛋白的2条明显的条带，并采用MALDI-TOF质谱仪肽指纹图谱鉴定了其互作蛋白。