一氧化氮对人气道平滑肌细胞钾通道的影响 前言 细胞兴奋性的改变可诱发多种疾病的发生。支气管哮喘是一种气道的慢性非特异性炎性疾病，其特征为可逆性气道狭窄和气道的高反应性。细胞膜电位（Em）在平滑肌兴奋性及其张力水平的调控中具有重要地位，它通过控制细胞膜钙离子通道的活性而影响细胞内钙离子的浓度。静息状态下，钾离子是形成Em的主要电流成分。气道平滑肌细胞（ASMCs）表现有多种类型的钾通道。研究表明，至少有三种钾通道在决定细胞膜电位，维持气道电活动的相对稳定，及调节气道对收缩舒张因子的反应性和神经系统对递质的释放方面起着重要作用。这三种钾通道分别为：钙激活K⁺通道(calcium-activated K⁺(K_Ca)channels)；ATP敏感K⁺通道(ATP-sensitive K⁺(K_ATP)channels)和电压依赖性延迟整流性钾通道（voltage-gated delayed-rectifier K⁺（Kv）channels）。由于这些钾通道的结构及在气管和各级支气管分布的不均一性，使其在气道平滑肌的功能方面起着不同的作用。有研究表明，K_V是决定气道平滑肌Em水平的重要钾通道之一。K_V活性的异常参与某些疾病的发病。我们先前的研究发现，K_V参与了大鼠支气管平滑肌静息张力及收缩张力的调控，K_Ca主要与收缩张力的调控有关，即限制ASM兴奋后的过度收缩。而K_ATP与ASM的张力调控无关；抑制大鼠ASMCs Kv的活性可促进平滑肌细胞的增殖；在大鼠ASMCs中，有两种钾通道电流成分存在，即K_V和BK_Ca电流。前者与Em相关，后者对Em无影响；哮喘ASMCs的K_V通道电流密度显著降低，其Em升高，细胞的兴奋性增高。而在人的ASMCs上，钾通道是如何调控气道平滑肌的Em及兴奋性，是否参与了气道平滑肌静息张力及收缩张力的调控，钾通道对HBSMCs增殖的影响，以及在哮喘中K_V活性是否发生变化，若有变化，是否与气道高反应性的病理生理机制形成有关，目前国内外均鲜见报道。一氧化氮是一种小分子化合物，具有众多病理生理过程，已有许多动物实验证明一氧化氮是一种重要的支气管舒张剂，既往大鼠实验发现一氧化氮可以通过开放钾通道舒张气道平滑肌，但在人的气道平滑肌的作用如何，尚不清楚。故本实验拟在我们以往研究的基础上，对上述问题进行探讨，以期进一步了解钾通道在哮喘发病中的作用，为临床防治哮喘提供实验资料。第一部分 钾通道在一氧化氮诱导的哮喘患者血清被动致敏的人气道平滑肌舒张中的作用 目的 探讨大电导钙依赖性钾通道（BKca）、电压门控钾通道（Kv）和ATP敏感性钾通道(K_ATP在一氧化氮（NO）诱发正常及哮喘血清被动致敏人气道平滑肌（human bronchial smooth muscle，HASM）张力变化中的作用。 方法 应用等长张力记录方法，以钾通道阻断剂为工具药，观察一氧化氮及联合钾通道阻断剂对正常人及哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌环收缩张力的影响。 结果 1．在正常组和哮喘血清被动致敏组中，Kv的阻断剂4-氨基吡啶（4-AP）可浓度依赖性地增加组胺引起的收缩反应，4-AP(1×10^-3 mol／L，5×10^-3 mol／L，1×10^-2mol／L)可显著提高组胺的收缩张力（p＜0.05），而K_ATP的阻断剂格列苯脲（Glib）(1×10^-2 mol／L)、BKca的阻断剂四乙铵（TEA）(1×10^-3 mol／L)对组胺引起的收缩反应无明显影响。被动致敏组中组胺的最大张力明显高于正常组（p＜0.05）。 2．NO供体硝普钠（SNP）对正常人及哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌都有舒张作用，其对被动致敏组的舒张作用[（29.4±3.3）％]明显低于正常组[（44.1±10.2）％]，两组比较有显著性差异（p＜0.05）。 3．Glib(1×10^-2 mol／L)对SNP的舒张作用无影响，4-AP(1×10^-2 mol／L)对SNP(1×10^-4 mol／L)的舒张效应有明显抑制作用（p＜0.01）。TEA(1×10^-3 mol／L)可明显抑制SNP的舒张作用（p＜0.05），并且在哮喘血清被动致敏组的抑制作用显著低于正常组（p＜0.05）。 结论 1．K_V主要参与静息状态下HBSM张力的调控，而K_Ca、K_ATP对其无明显影响。 2．NO供体硝普钠（SNP）部分通过BKca通道开放舒张人气道平滑肌。 3．在体外被动致敏状态下，NO使人气道平滑肌舒张效应减弱可能与BKca通道活性下调有关。第二部分 一氧化氮诱导哮喘气道平滑肌细胞凋亡 分题一 一氧化氮诱导体外哮喘大鼠支气管平滑肌细胞凋亡 目的 观察一氧化氮（NO）哮喘大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）生长和凋亡的影响。 方法 1．建立大鼠哮喘模型，分离出大鼠的气道平滑肌细胞。 2．用四甲基偶氮唑盐（MTT）微量比色分析法测定被动致敏的人气道平滑肌细胞生长率的变化影响。 3．用原位末端标记法检测SNP对被动致敏的人气道平滑肌细胞细胞凋亡的影响。 4．用流式细胞术检测SNP对被动致敏的人气道平滑肌细胞细胞凋亡的影响。 结果 1．MTT法测定：SNP+哮喘组的细胞抑制率明显高于哮喘组细胞存活率，（n=8，p＜0.05），且呈浓度依赖关系。 2．TUNEL（原位末端标记）法检测：SNP+哮喘组的凋亡指数明显高于哮喘组，（n=4，p＜0.05）。 3．流式细胞术测定SNP+哮喘组的平滑肌细胞凋亡率明显高于哮喘组，（n=4，p＜0.05）。 结论 1．NO能抑制哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖。 2．NO能诱导哮喘大鼠气道平滑肌细胞的凋亡，这种作用可能与治疗哮喘的气道重建有关。 分题二 一氧化氮诱导被动致敏的人气道平滑肌细胞凋亡 目的 观察一氧化氮（NO）是否诱导被动致敏的人气道平滑肌细胞（human airway smooth muscle cells，HASMCs）凋亡以及是否抑制人气道平滑肌细胞增殖。 方法 1．HASMC的培养：经患者（男5例，女4例，年龄23～70岁）同意，取肺肿瘤患者肺叶切除肿瘤旁远处正常的气道组织，将分离出支气管平滑肌剪成1mm×1mm的组织小块，消化、离心、重悬、滤过得到气道平滑肌细胞。 2 用四甲基偶氮唑盐（MTT）微量比色分析法测定哮喘大鼠平滑肌细胞生长率的变化影响。 3．用原位末端标记法检测SNP对哮喘大鼠气道平滑肌细胞细胞凋亡的影响。 4．用流式细胞术检测SNP对哮喘大鼠气道平滑肌细胞细胞凋亡的影响。 结果 1．MTT法测定：SNP+哮喘血清致敏组的细胞存活率明显低于哮喘血清致敏组细胞存活率，（n=5，p＜0.05）。 2．TUNEL（原位末端标记）法检测：SNP干预的被动致敏的HASMC组的凋亡指数明显高于哮喘血清致敏组，（n=4，p＜0.01）。 3．流式细胞术测定SNP+哮喘血清致敏组的HASMCs凋亡率明显高于哮喘血清致敏组，（n=4，p＜0.05）。 结论 1．NO能抑制被动致敏的HASMCs的增殖，2．NO能诱导被动致敏的HASMCs凋亡，这种作用可能与治疗哮喘患者的气道重建有关。 第三部分 一氧化氮对被动致敏人气道平滑肌细胞钾通道的作用 目的 观察一氧化氮（NO）供体硝普钠（SNP）对哮喘患者血清被动致敏人的气道平滑肌细胞膜电位（Em）及钾电流的影响。 方法 采用哮喘患者血清体外被动致敏的方法，将培养的人气道平滑肌细胞（HASMCs）分成三组：正常对照组、哮喘血清致敏组和SNP+哮喘血清致敏组，用标准全细胞膜片钳技术，记录经哮喘血清致敏的HASMCs膜电容、膜电位、钾电流及NO干预后钾电流的变化。 结果 1．正常对照组HASMCs的静息电位（Em）为—（40.1±5.8）mV，被动致敏组的Em为—（27.8±4.8）mV，两组比较被动致敏组的Em值明显降低（n=8，p＜0.05），被动致敏组呈去极化改变；SNP作用后被动致敏组Em为—（35.6±6.2）mV，呈复极化改变，与正常组相比无显著性差异（n=8，p＞0.05）。 2．在脉冲刺激方式和斜坡刺激方式下，被动致敏组的BKca电流密度显著低于正常对照组（n=8，p＜0.01）；而SNP作用被动致敏组后电流密度增加，与作用前比较有显著性差异（n=8，p＜0.05）。 3．在脉冲刺激方式和斜坡刺激方式下，被动致敏组的Kv电流密度显著低于正常对照组，（n=8，p＜0.05）；而SNP作用被动致敏组后电流密度增加，与作用前比较有显著性差异（n=8，p＜0.05）。 结论 1．经哮喘血清被动致敏的HASMC的膜电位呈去极化改变。 2．经哮喘血清被动致敏的HASMC的Kv和BKca钾通道活性下降。 3．SNP能增强哮喘血清被动致敏的HASMC的BKca和Kv活性，使HASMC膜电位复极化，提示NO可能通过开放BKca和Kv通道降低哮喘患者的HASMC的兴奋性。 总结 本实验通过从组织水平、细胞水平等，对大鼠和人气道平滑肌细胞（ASMCs）进行了系列的研究，得出以下结论： 1 NO供体硝普钠（SNP）部分通过BKca通道开放舒张人气道平滑肌。 2 NO能抑制哮喘大鼠及人气道平滑肌细胞的增殖。 3 NO能诱导哮喘大鼠及人气道平滑肌细胞的凋亡，这种作用可能与治疗哮喘的气道重建有关。 4 经哮喘血清被动致敏的HASMC的Kv和BKca钾通道活性下降。 5 SNP能增强哮喘血清被动致敏的HASMC的BKca和Kv活性，使HASMC膜电位复极化