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研究目的:研究神经调节蛋白-1(Neuregulin-1,NRG-1)对人心脏微血管内皮细胞(Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells,HCMECs)功能的影响,及其在缺血缺氧环境下对HCMECs活力的影响,并探讨其机制。研究方法:(1)使用qPCR检测NRG-1及ErbBs在HCMECs的表达水平;(2)使用携带siRNA干扰序列的shRNA慢病毒转染HCMECs,抑制HCMECs 中 NRG-1 的表达。将 HCMECs 分成 control 组、NRG-1 siRNA 组(siRNA组)、阴性对照病毒组(con-siRNA组)和外源加入rhNRG-1组(rhNRG-1组),慢病毒转染成功后使用qPCR和Western Blot检测各组HCMECs的NRG-1表达水平;使用CCK8试剂盒、划痕实验、Transwell细胞迁移实验及Matrigel基质胶管状形成实验,检测各组HCMECs的增殖、迁移和微血管管状形成能力;使用CCK8试剂盒检测各组HCMECs在缺氧及低血清(1%FBS)环境下的细胞活力。(3)将HCMECs分成control组、rhNRG-1 组及抑制剂组(rhNRG-1+GW572016 组、rhNRG-1+LY294002 组及 rhNRG-1+L-NEMA 组)。在 rhNRG-1 组,使用 rhNRG-1 孵育 HCMECs。在各抑制剂组,先用抑制剂孵育HCMECs 30分钟后再与rhNRG-1共孵育HCMECs。使用CCK8试剂盒检测不同时间点各组HCMECs增殖情况。在增殖变化差异最明显的第48h,qPCR检测各组HCMECs的VEGF表达水平,Western Blot 检测各组 HCMECs 的 T-eNOS、p-eNOS、T-Akt、p-Akt、VEGF 表达水平。(4)将 HCMECs 分成 normal 组、control 组、rhNRG-1 组及抑制剂组(rhNRG-1+GW572016 组、rhNRG-1+LY294002 组及rhNRG-1+L-NEMA 组)。control 组、rhNRG-1 组及各抑制剂组 HCMECs 均在缺氧及低血清(1%FBS)条件下培养。在rhNRG-1组,加入rhNRG-1孵育HCMECs。在各抑制剂组,分别用GW572016(1uM)(ErbB抑制剂)、LY294002(1uM)(P13K 抑制剂)和 L-NAME(1mM)(eNOS 抑制剂)对HCMECs进行预孵育30分钟,然后与rhNRG-1共孵育HCMECs 12h。使用CCK8试剂盒检测各组HCMECs干预后的细胞活力,再使用Western Blot检测各组 HCMECs 的 T-eNOS、p-eNOS、T-Akt、p-Akt、VEGF 表达水平。研究结果:(1)HCMECs 高表达 NRG-1、ErbB2、ErbB3,低表达 ErbB4。(2)shRNA慢病毒转染能显著抑制HCMECs表达NRG-1(P<0.001)。(3)与control组比较,rhNRG-1组HCMECs的增殖和迁移能力明显增强(P<0.001),siRNA组HCMECs的增殖和迁移能力受到明显抑制(P<0.001)。与control组比较,siRNA组HCMECs形成血管网眼数目显著减少(P<0.001),rhNRG-1组HCMECs形成血管网眼数目无明显差异(P>0.05)。(4)使用抑制剂和rhNRG-1共孵育HCMECs,NRG-1对HCMECs的促增殖作用减弱(P<0.01)。在增殖变化差异最明显的第48h,qPCR结果显示,相应的抑制剂均可下调NRG-1介导HCMECs表达VEGF的水平(P<0.05);同样,Western Blot结果提示,相应的抑制剂均可减弱NRG-1促进HCMECs表达p-Akt、p-eNOS、VEGF的作用(P<0.05)。(5)在缺氧及低血清(1%FBS)环境下,与control组比较,rhNRG-1组HCMECs活力显著提高(P<0.05),siRNA组HCMECs活力受到明显抑制(P<0.001)。加入相应抑制剂后,rhNRG-1对HCMECs的保护作用减弱。与control组比较,rhNRG-1组HCMECs在缺血及低血清(1%FBS)环境中p-Akt、p-eNOS、VEGF表达水平提高,而使用抑制剂与rhNRG-1共孵育后,HCMECs的p-Akt、p-eNOS、VEGF表达水平均下调。但与normal组比较,control组HCMECs在缺血及低血清(1%FBS)环境中表达的p-Akt减少,而p-eNOS表达增加,VEGF表达未受影响。结论:(1)NRG-1能显著促进HCMECs的增殖和迁移功能。(2)NRG-1可能通过ErbB-PI3K/Akt-eNOS-VEGF信号通路促进HCMECs增殖。(3)NRG-1减轻缺氧及低血清环境下HCMECs的损伤,与NRG-1上调细胞中p-Akt、p-eNOS、VEGF 的表达有关。