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研究背景及目的:糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病患者长期存在的高血糖水平,可导致眼、肾、心脏、神经等器官的慢性损害、功能障碍。临床上通过多次注射或持续皮下注射胰岛素,可以推迟或减缓糖尿病慢性并发症的发生或进展。然而,尽管在胰岛素制剂、胰岛素输送装置和毛细血管血糖监测等方面取得了进展,一些患者仍无法达到相对安全的代谢控制程度,反复地出现高血糖或低血糖,严重者甚至危及生命。对于外源性胰岛素难以控制血糖水平的糖尿病患者,胰岛移植是一种有效的治疗方式。胰岛移植通过将供体胰岛输注入糖尿病患者体内,来补充内源性胰岛素水平的不足。临床上首选的手术方式是经门静脉穿刺注射,约90%以上的胰岛移植是通过这种方式,将胰岛细胞输注入肝脏中,胰岛细胞在肝窦内生长并分泌胰岛素。肾包膜、脾、腹膜、大网膜等也是重要的移植部位。在Edmonton方案得到推广后,移植5年后胰岛素脱离率可达50%,提示当前胰岛移植术仍有一定局限性。胰岛细胞早期排异丢失及免疫抑制剂的药物不良反应,仍是胰岛移植远期疗效差的主要原因。胰岛移植术后,T细胞介导的排斥反应的发生,是胰岛移植物丢失的重要因素。因此,进一步研究胰岛移植后排斥反应的主要机制、寻找新的抗排异手段,是当前胰岛移植基础研究中急待解决的热点问题。免疫检查点是机体内一系列调控免疫系统的抑制性信号通路,对于机体调节免疫应答、维持免疫耐受以及防止自身组织损伤均具有重要意义。免疫检查点的激活和高表达,可以抑制活化T细胞的增殖及功能,下调T细胞的活性,对人体免疫系统起到平衡调节的作用。肿瘤免疫治疗中,通过阻断免疫检查点受体-配体的相互作用,逆转T细胞的免疫耗竭状态而发挥抗肿瘤效应。本研究通过对小鼠同种异体胰岛移植中免疫检查点分子的表达进行分析,筛选出具有潜在抗排异作用的靶点。同时,构建稳定的脂质体表面修饰系统以挂载靶点配体分子,延长免疫检查点配体分子的体内半衰期,以期在体内抑制同种抗原引起的淋巴细胞活化。最后,观察该脂质体对胰岛移植物的保护作用,研究其抑制排斥反应的机制,为胰岛移植的早期抗排斥反应探寻新的治疗策略。第一部分:同种胰岛移植物排斥反应发生过程中免疫检查点分子的表达分析目的:研究同种胰岛移植物排斥反应发生过程中,相关免疫检查点受体蛋白的表达变化,筛选具有潜在抗排斥作用的靶点。方法:通过同种小鼠混合淋巴细胞培养和T细胞体外活化扩增,Western-Blot检测免疫检查点受体蛋白的表达情况。结果:混合淋巴细胞培养和T细胞体外活化扩增过程中,VISTA蛋白在活化全程表达,LAG-3蛋白主要在活化早期高表达,PD-1蛋白主要在活化晚期高表达。结论:同种胰岛移植物排斥反应发生过程中,联合靶向免疫检查点受体LAG-3和PD1,或单独靶向VISTA,可能具有潜在抗排斥作用。第二部分:脂质体表面修饰系统的建立目的:建立脂质体表面修饰系统,以进一步稳定地构建负载免疫检查点配体分子的人工脂质体。方法:1.通过超声薄膜法构建脂质体,运用链霉亲和素-生物素系统挂载相关蛋白元件;2.免疫荧光检测脂质体挂载效率。结果:该方法制备的人工脂质体直径稳定在100-200nm之间,并可挂载生物素化的蛋白片段。该人工脂质体系统同时具有较高的挂载效率和较好的挂载特异性。结论:该脂质体表面修饰系统方法稳定,可有效地负载免疫检查点配体。第三部分:VISTA人工脂质体干预同种胰岛移植物排斥反应的初步研究目的:以VISTA分子为靶点,初步探究激活免疫检查点分子对胰岛移植中排斥反应的影响,明确负载脂质体的必要性。方法:1.建立同种小鼠混合淋巴细胞培养模型,对比分析VISTA蛋白对淋巴细胞增殖和活化的影响;2.建立小鼠同种异体胰岛移植模型,设置生理盐水组、10pmol VISTA蛋白组、100pmol VISTA蛋白组和100pmol VISTA-Fc蛋白组,对比分析不同类型药物对胰岛移植物的保护效果;3.构建VISTA脂质体,探究其体内药物代谢动力学特性;4.设置空载脂质体组、VISTA脂质体组和低剂量雷帕霉素组,研究VISTA脂质体对胰岛移植物的保护效果。结果:1.与对照组相比,VISTA蛋白可以显著抑制淋巴细胞的增殖和活化;2.与对照组相比,单纯改变VISTA药物浓度无法显著抑制移植排斥反应;3.与单纯VISTA蛋白相比,VISTA脂质体可显著延长VISTA蛋白体内半衰期;4.与对照组相比,VISTA脂质体可显著延长同种胰岛移植物的存活时间。结论:脂质体系统有助于免疫检查点配体分子更好地在体内发挥生物学作用,负载脂质体具有必要性。第四部分:FGL1/PD-L1人工脂质体干预胰岛移植排斥反应的机制研究目的:研究挂载FGL1/PD-L1分子的人工脂质体对胰岛移植物的保护效果,探究其参与移植排斥反应的机制。方法:1.运用超声薄膜法和链霉亲和素-生物素系统,制备挂载FGL1/PD-L1分子的人工脂质体;2.体外检测FGL1/PD-L1脂质体对混合淋巴细胞反应的影响及相关信号通路的变化情况;3.建立小鼠同种异体胰岛移植模型,设置生理盐水组、FGL1脂质体组、PD-L1脂质体组、FGL1/PD-L1脂质体组和正常剂量雷帕霉素组,定期检测小鼠血糖、C肽水平的变化情况。结果:1.FGL1/PD-L1脂质体在混合淋巴细胞反应中可以显著抑制淋巴细胞的增殖、活化,减少IFN-γ的分泌。PD-L1主要通过活化SHP1,从而抑制SYK和VAV活化所介导。FGL1主要通过上调TOX和NR4A的表达,TOX和NR4A进入细胞核内后,抑制细胞因子的分泌、抑制T细胞的增殖和细胞毒活性,同时诱导PD-1的表达上调而进一步发挥抑制作用;2.与其它四组相比,FGL1/PD-L1脂质体可显著保护胰岛移植物,延长其生存时间。结论:FGL1/PD-L1脂质体可有效抑制移植排斥反应,延长胰岛移植物的存活。