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微生物氨基酸转运系统在氨基酸生产菌株育种研究中得到广泛运用,对氨基酸的吸收和分泌运输途径进行改造,可以促进微生物胞内氨基酸的合成和胞外氨基酸的积累。本论文以大肠杆菌（Escherichia coli）W3110为研究对象,通过Red重组技术分别敲除E.coli L-蛋氨酸MetD氨基酸吸收转运系统编码基因metN、metI和metQ,对不同基因缺失菌株L-蛋氨酸吸收速率进行比较;在此基础上分别强化E.coli L-蛋氨酸YjeH和YeaS分泌系统,比较不同菌株胞外L-蛋氨酸的积累;最后染色体整合替换表达Salmonella typhimurium来源的CysB激活蛋白,比较替换CysB激活蛋白后硫代谢途径相关基因的表达情况和胞外L-蛋氨酸的积累。论文主要结果如下:通过Red重组技术敲除E.coli L-蛋氨酸MetD氨基酸吸收转运系统编码基因metN,metI和metQ,与E.coli W3110相比,L-蛋氨酸MetD氨基酸吸收转运系统单基因缺失均能够降低菌体向胞内吸收L-蛋氨酸的速率,其中metI基因的缺损对胞外L-蛋氨酸的吸收影响最大,metI基因缺失菌株M12向胞内吸收L-蛋氨酸的速率降低了16.7%。构建质粒pET-ABY用于解除蛋氨酸代谢途径的反馈抑制,增强蛋氨酸的合成,重组菌株M12（pET-ABY）并不能在胞外积累蛋氨酸。构建用于强化蛋氨酸分泌系统YjeH的重组质粒pKK-yjeH,转入M12（pET-ABY）,菌株M12（pKK-yjeH/pET-ABY）,胞外蛋氨酸最大积累量为0.21 g·L-1,将yjeH基因单拷贝整合到基因组上,构建菌株M14,分析游离表达与整合表达对蛋氨酸胞外积累的影响,菌株M14（pET-ABY）最大胞外蛋氨酸积累量为0.48 g·L-1,与游离表达相比,蛋氨酸产量提高了128%,产率提高了85.7%,在敲除吸收系统的基础上,yjeH运输系统的过表达能够促进大肠杆菌胞外蛋氨酸的积累。同时考察了蛋氨酸YeaS运输系统游离表达与整合表达对大肠杆菌蛋氨酸积累的影响,蛋氨酸胞外积累量分别为0.18 g·L-1,0.25 g·L-1,与游离表达相比,yeaS的整合表达蛋氨酸的产量提高了38.9%。可见,从蛋氨酸的转运系统出发,弱化胞内运输途径,表达蛋氨酸分泌途径是构建蛋氨酸分泌菌株行之有效的办法,在蛋氨酸吸收系统缺失的情况下,分泌系统的整合表达更加有利于蛋氨酸的胞外积累,与YeaS运输系统相比,YjeH转运系统对蛋氨酸转运的促进作用更强。CysB激活蛋白调控大肠杆菌硫代谢过程中cys操纵子,分别过表达cysC、cysK、cysM、cysP、cysU和cysE,与M14（pET-ABY）相比,L-蛋氨酸产量由0.48 g·L-1分别提高到0.57,0.63,0.60,0.63,0.64,0.72 g·L-1,Cys操纵子调控的解除可以增强L-蛋氨酸代谢过程总硫元素的供给,促进L-蛋氨酸的合成和胞外积累。为了从染色体水平上解除CysB蛋白的调控作用,将外源基因cysBT149P整合到染色体替换E.coli内源Cys B激活蛋白构建菌株M16,与M14菌株相比,M16菌株cys C、cysK、cysM、cysP、cysU基因的表达比率分别上调了7.12、3.72、4.67、4.43、4.24倍;M16（pET-ABY）最大胞外L-蛋氨酸的积累量为0.53 g·L-1,与M14（pET-ABY）相比产量提高了15.2%。CysBT149P的整合替换能够有效地解除cys操纵子的调控,提高L-蛋氨酸生物合成硫代谢途径相关基因的表达量,促进L-蛋氨酸的合成。