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干旱、盐害等非生物胁迫严重影响植物的生长发育和产量,转录因子在调节植物生长发育及对环境胁迫的适应性方面起着非常重要的作用。其中,DREB类转录因子是植物体内一种非常重要的转录因子,已被证明在改良植物抗逆性方面有重要的应用价值。OsDREB1基因是水稻中被克隆到的DREB家族的基因之一,前期研究表明该基因能受低温等非生物胁迫诱导,且水稻和拟南芥异源超表达OsDREB1基因,提高转基因株系对干旱、高盐和冷害胁迫的抗性。本研究在对根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化系统中萌发条件和生根条件优化的基础上,利用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统将构建的OsDREB1超表达载体转入华春3号和桂夏豆2号中,获得转基因植株,并对转基因植株T2代进行非生物胁迫抗性鉴定。主要研究结果如下:
1)分别利用3种氯气浓度(100％、80%、60%)对华南地区11个大豆品种进行灭菌处理,结果表明,华春1号,2号,3号,6号适合用100%氯气浓度灭菌,萌发率分别为93.43%,93.72%,71.37%和82.35%;华夏1号,3号,4号,6号,8号和桂夏豆2号适合用80%氯气灭菌,萌发率分别为90.98%,66.67%,72.16%,89.81%,72.94%和70.59%。
2)利用IBA(500 mg/L,浸蘸2 min),IBA(0.5 mg/L,持续处理),NAA(500mg/L,浸蘸2min)和NAA(0.5mg/L,持续处理),4种不同激素浓度对华夏号组mg/L,浸蘸2 min)和NAA(0.5 mg/L,持续处理),4种不同激素浓度对华夏3号组培苗进行生根处理,结果表明,在4种不同处理方法中,IBA(500 mg/L、,浸沾2 min)和IBA(0.5 mg/L,持续处理)两种处理方法可快速诱导大豆组培苗主根和侧根生长。
3)应用优化的根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化系统,以华春3号和桂夏豆2号为受体,成功地将OsDREB1基因转入大豆,采用目的基因和35S的特异引物对转基因株系T0到T2代进行PCR鉴定。结果表明,OsDREB1基因己整合到转基因大豆基因组中。RT-PCR结果表明,OsDREB1基因在转基因植株中稳定表达。
4)利用不同浓度NaC1对苗期转基因株系T2代和野生型进行胁迫处理,12天后分析其表型差异,结果表明,转基因2号株系对盐胁迫的耐受性得到增强。
5)在V1期,将经胁迫处理(0天、3天、6天、9天)后的转基因大豆与野生型植株分别取样,测定其生理指标。结果表明,在盐胁迫处理下,转基因植株和野生型植株的脯氨酸含量、可溶性糖含量以及MDA含量均升高。与野生型植株华春3号相比,转基因2号株系脯氨酸含量为野生型的1.7倍,可溶性糖含量为野生型的2倍;与野生型植株桂夏豆2号相比,转基因4号株系脯氨酸含量为野生型的2.4倍,可溶性糖含量为野生型的3.3倍。结果表明,OsDREB1转基因植株对盐胁迫的耐受性显著提高。
总之,通过改变氯气浓度和激素浓度,从种子萌发和组培苗生根两个方面对农杆菌介导的大豆子叶节转化法进行了优化,探索出适合华南地区大豆品种的萌发和生根条件。应用优化的转化体系对OsDREB1基因进行遗传转化并获得转基因株系。生理实验的结果表明,OsDREB1基因异源超表达可显著提高大豆耐盐性。