论文部分内容阅读
人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hESCs在多个领域,如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。第一章:人胚胎干细胞株HSF6培养。目的:探索和建立人胚胎干细胞株HSF6的培养方法。方法:从ICR胎鼠(E13.5)中分离胚胎成纤维细胞(mouse embryonicfibroblast,MEF),检测丝裂霉素C处理或γ射线照射后MEF的生长状态并作为hESCs饲养层;将hESCs培养于含10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的KO-DMEM培养基中,采用hESCs的酶消化法传代和机械法(巴氏德管制作的传代工具)传代;并对培养的HSF6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体(embryoid body,EB)分化能力检测等特征鉴定。结果:第3-5代的MEF经10μg/mL丝裂霉素C处理1-3小时或经3000Radγ射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hESCs克隆大小不均,分化克隆容易残留和扩增;机械法传代的hESCs克隆大小较均匀,分化克隆残留较少或培养中容易被剔除,但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大;培养的HSF6能维持未分化状态。结论:①建立了ICR胎鼠(E13.5)MEF的分离和培养方法,10μg/mL丝裂霉素C处理1-3小时,或3000Radγ射线照射后可作为HSF6的饲养层;②酶消化法和机械法均可用于hESCs的传代。第二章:hESCs体内分化途径获取神经干细胞。目的:从hESCs畸胎瘤中分离人神经干细胞(neural progenitor cells,NPC)。方法:将hESCs注射到SCID鼠体内分化为畸胎瘤,采用贴壁培养法从中分离人NPC;免疫组织化学法检测NPC标记—巢蛋白(nestin);检测NPC分化能力,对分化细胞检测神经元标记—β微管蛋白Ⅲ(Neuron-specific classⅢbeta-tubulin,TuJⅠ)和胶质细胞标记—胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。结果:hESCs注射SCID鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤,经过贴壁培养和连续传代从中分离到NPC,免疫组织化学检测nestin呈阳性,能分化为神经元和神经胶质细胞,分别表达TuJⅠ和GFAP。结论:①利用贴壁培养法可从hESCs畸胎瘤中分离到NPC;②“hESCs-SCID鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。第三章:Dnmt3a和Dnmt3b表达下调对hESCs的影响。目的:研究DNA新生甲基化酶Dnmt3a(DNA methyltransferase 3a)和Dnmt3b(DNA methyltransferase 3b)表达下调后对hESCs的影响。方法:观察Dnmt3a与Dnmt3b表达下调后hESCs的生长特性;免疫荧光检测hESCs表面标记;RT-PCR检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因;检测hESCs体外EB分化情况,在不同分化时间行AKP染色和RT-PCR检测三个胚层基因表达情况;检测hESCs在SCID鼠体内分化能力。结果:Dnmt3a和Dnmt3b表达下调后hESCs:在MEF上呈克隆式生长,表面标记检测呈hESC特征,表达Oct3/4、Sox2和Nanog;EB分化障碍、AKP消退延迟,Dnmt3b下调后hESCs分化时神经外胚层标记基因提前出现;Dnmt3a和Dnmt3b表达下调后hESCs在SCID小鼠体内未形成畸胎瘤。结论:①Dnmt3a和Dnmt3b表达下调后不影响hESCs未分化状态的维持,推测Dnmt3a和Dnmt3b不是hESCs未分化状态维持所必需的;②Dnmt3a和Dnmt3b表达下调导致hESCs分化缺陷,推测Dnmt3a和Dnmt3b是hESCs正常分化所必需的。