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糖尿病(Diabetes mellitus，DM)对中枢神经系统的影响已引起人们的广泛重视，由于DM本身的代谢絮乱和微血管病变所致的大脑功能异常，糖尿病脑病(Diabetic encephalopathy,DE)也是糖尿病的主要并发症之一。高糖(High glucose，HG)导致的内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）在DE的发生发展过程中起到了关键性作用。萝卜硫素（Sulforaphane，SF）是西兰花等十字花科蔬菜中的提取物，对癌症、神经退行性病变及糖尿病等多种慢性疾病具有一定疗效。本文通过离体HG培养原代海马神经元模拟在体情况和建立1型糖尿病(T1D)小鼠模型，探讨HG对海马神经元ERS发生发展的影响，并研究SF对糖尿病海马神经元的保护作用及可能的机制，为临床预防和治疗DE提供新的理论依据。 第一部分 萝卜硫素抑制高糖诱导小鼠原代海马神经元内质网应激依赖的凋亡 目的: 通过体外原代培养小鼠海马神经元，探讨HG对海马神经元ERS发生发展的影响，并研究SF在HG诱导海马神经元ERS中的作用及可能的机制。 方法: 1.提取并原代培养新生24h昆明小鼠海马神经元，倒置显微镜观察神经元形态结构，用神经元NeuN抗体对海马神经元进行鉴定。 2.用CCK-8法筛选HG作用浓度和SF作用浓度。 3.实验分为正常组(NC)、高糖处理组(HG)、高糖处理+萝卜硫素预处理组(HG+SF)，HG作用12h或72h后，收取细胞。 4.原位末端转移酶标记法（TUNEL）检测各组细胞凋亡。 5.免疫荧光检测各组细胞GRP78蛋白表达。 6.通过Real time PCR和Western Blot技术，检测各组细胞GRP78、ATF6、P-JNK、JNK、Caspase-12基因及蛋白的表达。 结果: 1.小鼠海马神经元原代培养至6天时，神经元胞体丰满，突起延长，交织成网络。用神经元NeuN抗体对海马神经元进行鉴定，神经元纯度达90％以上，可以用于后续实验。 2.用不同浓度的HG处理神经元24h后，60mM HG浓度能使神经元活性明显降低，并有显著性差异(P＜0.05);不同浓度的SF处理神经元24h后，发现2.5μM以上浓度对细胞存在明显毒性，参考以前文献，选择0.5μM SF应用于后续的实验。 3.TUNEL染色证实，TUNEL阳性细胞呈绿色斑点状。与NC组相比，HG诱导12h组TUNEL阳性细胞增多(P＜0.05)，诱导72h组TUNEL阳性细胞明显增多(P＜0.01);与HG组比较，SF组阳性细胞在12h、72h均明显减少(P＜0.05，P＜0.01)。 4.免疫荧光结果显示，GRP78表达于胞浆，呈绿色荧光。与NC组比较，HG诱导细胞12h组GRP78表达明显增加，诱导72h组则表达减少;与HG组比较，SF处理组GRP78在12h时表达减少，在72h时表达增加。 5.SF对HG诱导海马神经元ERS及相关信号通路蛋白表达的影响，结果显示，与NC组相比，HG诱导细胞12h组，GRP78、ATF6蛋白表达水平明显上调(P＜0.05，P＜0.05)，诱导72h组又表达下调(P＜0.001，P＜0.01);与HG组相比，SF处理组在12h时GRP78、ATF6蛋白的表达降低(P＜0.05，P＜0.05)，在72h时表达增加(P＜0.05，P＜0.05)。HG诱导细胞12h、72h组与相应NC组比较，P-JNK蛋白均有不同程度上调(P＜0.001，P＜0.01);而与HG组相比，SF处理组P-JNK蛋白在12h、72h均表达下调(P＜0.05，P＜0.01)。 6.SF对HG诱导海马神经元CHOP基因表达水平的影响，结果表明，NC组、HG诱导12h组以及SF预处理组之间CHOP基因表达水平无明显变化，HG诱导72h组CHOP基因表达与NC组比较显著上调(P＜0.01)，而SF处理组与HG组相比在72h时表达明显降低(P＜0.05)。 第二部分 萝卜硫素对1型糖尿病小鼠海马区神经元的保护作用及相关机制研究 目的: 通过建立T1D小鼠模型，进一步探讨随着时间延长，海马区神经元内ERS的变化，研究SF和硫氧还蛋白(Trx)抑制剂(PX12)处理T1D小鼠后，对海马区神经元ERS的影响，明确SF对T1D小鼠海马神经元保护的机制，为临床预防和治疗糖尿病脑病提供关键靶点和新的理论依据。 方法: 1.采用链脲佐菌素(STZ)注射的方法建立T1D小鼠模型。实验分成正常组(NC)、糖尿病组(T1D)、萝卜硫素预处理组(T1D+SF)、萝卜硫素+PX12预处理组(T1D+SF+PX12)。分别在造模成功第1天(1d)、3天(3d)、1周(1w)、2周(2w)、4周(4w)记录各组血糖变化，并取相应小鼠大脑及海马区组织。 2.TUNEL技术原位检测各组小鼠海马区神经元凋亡。 3.取小鼠海马区组织，电镜观察各组海马区神经元超微结构。 4.通过Real time PCR和Western Blot技术，检测各组小鼠海马区ERS和相关信号通路基因蛋白的表达。 5.免疫组织化学技术检测各组小鼠海马区中GRP78、CHOP蛋白的表达。 结果: 1.小鼠血糖的变化。与NC组相比，T1D、T1D+SF和T1D+SF+PX12组血糖在1d、3d时均明显升高，1w时达到最高值，并在2w、4w时基本保持不变;T1D、T1D+SF、T1D+SF+PX12组之间血糖无明显差异。 2.TUNEL阳性信号呈绿色斑点呈现于细胞核。与NC组相比，T1D组小鼠海马区TUNEL阳性细胞在1d时数量增加(P＜0.05)，4w时阳性细胞明显增加(P＜0.001);SF处理组与T1D组比较，在1d、4w时TUNEL阳性细胞均显著减少(P＜0.05，P＜0.001);SF和PX12联合处理组与T1D+SF组比较，TUNEL阳性细胞在1d、4w时增加，其中4w时有显著性差异(P＜0.01)。 3.小鼠海马区超微结构在4w时显示，NC组细胞核呈椭圆形，核膜完整，内质网排列致密、连贯，细胞内线粒体结构正常;T1D组内质网扩张，连贯性破坏，部分线粒体肿胀，嵴减少，形成较宽的电子透亮区，出现空泡化;T1D+SF组内质网、线粒体的扩张和肿胀得到明显改善;T1D+SF+PX12组则与T1D组相似，同样出现了扩张的内质网，线粒体有轻度损伤。 4.GRP78蛋白在T1D小鼠海马区不同时间点表达结果显示，T1D1d、3d、1w、2w组GRP78蛋白表达水平均高于NC组，1d组表达最高(P＜0.01)，T1D4w组GRP78表达水平低于NC组(P＜0.05)。 5.SF和PX12对T1D小鼠1d和4w时海马区ERS相关蛋白表达的影响，结果显示，与NC组相比，T1D组在1d时Trx-1蛋白表达水平无明显变化，4w时表达水平明显下调(P＜0.05);SF处理组与T1D组比较，在1d和4w时Trx-1表达均显著增加(P＜0.01，P＜0.05);SF和PX12联合处理组与T1D+SF组相比，Trx-1在1d和4w时表达明显减少(P＜0.05，P＜0.05)。T1D组与NC组比较，ERS相关蛋白GRP78、ATF6在1d时均表达上调(P＜0.001，P＜0.05)，4w又表达下调(P＜0.01，P＜0.05);与T1D组比较，SF处理组GRP78、ATF6在1d表达减少(P＜0.01，P＜0.01)、4w表达增加(P＜0.05，P＜0.05);SF和PX12联合处理组与T1D+SF组比较，GRP78、ATF6在1d表达增加(P＜0.05，P＜0.05),4w表达减少(P＜0.05，P＜0.05)。 结论: 1.HG诱导了海马神经元ERS的发生与发展，最终导致了细胞的凋亡，SF的应用能明显改善HG触发的小鼠海马神经元ERS及细胞凋亡情况。 2.在小鼠T1D模型中，ERS相关蛋白GRP78、ATF6在T1D早期表达上调，随着时间延长，第4周表达下调，可能与过度的ERS有关。 3.SF可能通过作用于Trx这一关键靶点，抑制ERS中CHOP-Bax/Bcl-2、JNK、Caapase-12信号通路，从而保护HG引起的海马神经元凋亡。