地中海贫血在世界范围内分布广，发病率高，危害大，长期以来其相关研究一直是生物医学研究的热点。重型β地中海贫血可以被异常高表达的γ基因改善临床症状的现象，促使科学家围绕着如何阻止γ—珠蛋白基因向β—珠蛋白基因切换及如何重新激活已趋于关闭的γ—珠蛋白基因等问题开展了各种各样的研究工作。已经发现一些正向作用元件与反向作用因子，如：SSE(stage selector element)、LCR(Local controlregion)及GATA-1、AP1、SP1、EKLF(Erythroid Kruppel-like factor)与NF-E2等与γ及β—珠蛋白基因的表达切换有关。某些药物如羟基脲、丁酸盐等可以诱导γ—珠蛋白基因重新表达，但在临床应用过程中却呈现出个体差异。研究发现，羟基脲可使cGMP增加，后者可能影响某些转录因子而干预γ—珠蛋白基因表达。丁酸盐可抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，还可以通过抑制ERK、激活p38信号转导通路而诱导K562细胞向红细胞系分化。但其作用机理还有待进一步阐明。 近年来人们发现了一种新的基因调节因子—微小RNA。微小RNA的片断大小在～22nt左右，包括siRNA、miRNA及属于miRNA的stRNA。它们引起与其碱基互补的mRNA降解或翻译抑制，表现为基因转录后沉默。已经在包括人类在内的许多生物体发现了它们的存在。它们的功能涉及到基因组印记、RNA干扰、转录调控及选择性剪切等多个领域。在小鼠骨髓造血细胞的分化过程中也发现有miRNA的参与。在药物诱导HbF表达的过程中，是否有miRNA的参与，目前还未见相关报道。尤其是人红白血病细胞K562，在羟基脲及丁酸盐诱导下发生了向红细胞系的分化，在个体发育及组织细胞分化过程中具有调节基因表达功能的miRNA是否也参与其中呢?另一株人红白血病细胞HEL可以在羟基脲诱导下发生β—珠蛋白基因的转录，但在蛋白质水平却无可检测到的β—肽链，这属于转录后基因沉默，具有这一调节功能的微小RNA是否也参与其中?为了解决这些疑问，我们试图从用药前后K562细胞及HEL细胞中分离微小RNA，以期发现可能参与诱导γ、β—珠蛋白基因表达的miRNA。试图为珠蛋白基因调控机制的研究寻找新的突破口。 第一步，我们对K562细胞在羟基脲及丁酸盐作用下、HEL细胞在轻基脉作用下发生向红细胞系分化的现象进行了验证。结果:在轻基脉及丁酸盐作用下，K562细胞联苯胺染色阳性细胞数在第48小时及第72小时，均较未用药组显著增加。RT.pcR检测用药组GY珠蛋白基因表达水平也持续增高，与未用药组相比差异显著。HEL细胞用药组细胞联苯胺染色结果与未用药组相比无变化，但在第72小时用药组细胞出现RT一cR可检测到的p一珠蛋白基因表达。选择对药物诱导反应好的用药第60小时的细胞作为第二步的研究对象。 第二步，我们进行了微小RNA的分离与鉴定工作。方法:大批量培养用药与未用药的K562细胞、HEL细胞。药物作用第60小时收集细胞，提取细胞总RNA。每份RNA标本中均加入少量25nt、18nt的RNA MaJ火er作为内对照。测序胶分离及回收RNA标本中片断大小位于18一25nt的微小RNA。为微小RNA的3’端及5’端分别加DNA一RNA嵌合体接头，以为微小RNA3’及5’端引入共同序列。测序胶分离回收成功添加接头的产物。回收的微小RNA经RT.PCR扩增，经上下游引物为PCR产物两端引入酶切位点。纯化后的PCR产物经酶切、再纯化后，在高浓度T4DNA酶作用下形成随机串连体，凝胶分离回收100一soobp之间的片断。补平末端及为3’端加A尾。再次纯化后，与T载体连接、制备A一T克隆。用自制的超高效JM 109感受态细菌进行转化。PCR及酶切法筛查含插入片断的阳性克隆。结果:K562细胞未用药组7个质粒，K562细胞丁酸盐诱导组6个质粒，K562细胞轻基脉诱导组6个质粒，HEL细胞未用药组5个，HEL细胞轻基脉诱导组6个质粒交鼎国生物技术公司测序。最终5组细胞的克隆共得到5个新RNA片断:aaugggggcaaugguaaugg(K562细胞未用药组测到1次);~cggagcggccaccc(K562细胞丁酸盐组测到1次);~cggagcgccacac(HEL细胞测到1次);姐uggggccaaugguaaugguguu(HEL细胞经基脉组测到l次);aaugggggcaaugguaaugguggu(K562细胞未用药组测到1次，K562细胞经基脉组测到2次，HEL细胞未用药组测到2次)。另外5组细胞均测到RNAM出火er内对照序列。经与Genbank作同源性比较，其中的2个新RNA片断可以在人类基因组找到同源基因序列。将它们与其所在每个同源基因位点的上下游70个碱基分别加下上游巧个碱基组成两种可能的RNA前体序列，DNAsis2.5软件对RNA前体的二级结构进行预测。最 4终发现，形成的二级结构不符合m1RNA的鉴定标准，即不是典型的发夹状结构，排除了它们是m1RNA的可能性。另三个在Genbank则没有发现完全匹配的同源基因，在m1RNA数据库中也未找到序列相近的己注册而RNA，故也不符合而RNA的鉴定标准。 结论:经过严格的分离微小RNA操作过程，最终得到5个微小RNA，但经基因同源性比较、RNA前体二级结构预测等，均予以排除为miRNA。由于内对照成功克隆、测序，可以排除阴性结果是由人为操作失误造成。此结果的出现说明:1.?