论文部分内容阅读
胰腺癌（PC）被称为“癌症之王”,全球死亡率位于第7位。根据2019年国家癌症中心统计数据,2015年中国PC发病率位于第10位,但死亡率却高居第6位。治疗PC的手段包括手术、化疗、分子靶向治疗、内镜下姑息化疗和生物靶向治疗。化疗是治疗晚期或转移性PC的标准方案,但疗效十分有限,死亡率仍然居高不下。与其它癌症相似,PC发生发展除了与癌细胞内抑癌分子失活或促癌分子过度激活所致的信号网络紊乱有关,可能还有其特殊性。FOXO3a是FOXO叉头转录因子亚家族的成员,介导多种细胞生物学过程,包括细胞凋亡、增殖、细胞周期、DNA损伤和肿瘤发生。它还响应几种细胞应激,如紫外线照射和氧化应激。FOXO3a的功能受复杂的网络调节,包括微小RNA（mi RNA）的转录后抑制,翻译后修饰（PTM）和蛋白质-蛋白质相互作用。FOXO3a分布和作用广泛,涉及多种疾病的发生发展。FOXO3a是肿瘤抑制因子,FOXO3a因基因突变或蛋白的细胞质螯合而失活,其失活与癌症的发生和发展有关。癌基因或抑癌基因在癌症发生发展中的作用通常涉及与其它基因和蛋白质的相互作用或调节网络,阐明这些相互作用和调节网络本质有助于阐明癌症发生机制。JWA基因又称ARL6ip5,是活跃的环境应答基因,其编码蛋白定位于细胞内质网和线粒体,是细胞骨架结合蛋白。已知JWA是多功能蛋白,包括修复DNA损伤和抑制细胞迁移等;此外,已证明JWA具有抑癌基因的功能,在促进癌细胞凋亡和抑制癌细胞粘附、血管新生和转移中发挥重要作用。本研究用基因转染和小分子激动剂等手段提高细胞JWA表达水平,探讨其通过FOXO3a调控细胞能量代谢影响胰腺癌细胞迁移和转移的作用和分子机制。目的:探讨JWA通过FOXO3a调节细胞能量代谢,抑制胰腺癌细胞迁移和转移的作用和分子机制。方法:采用蛋白免疫印迹法检测JWA和FOXO3a等分子在胰腺癌细胞中的表达。通过转染Flag-JWA质粒或使用JWA基因小分子激动剂JAC4处理人胰腺癌细胞,采用划痕实验、穿孔实验、Seahorse XF能量代谢分析仪分别检测细胞迁移能力以及能量代谢水平的改变。用小鼠PDX模型和被动转移模型检测JAC4抑制胰腺癌生长和转移的作用。为探索JWA基因通过胰腺癌细胞能量代谢的途径调节细胞迁移,多种基因特异性抑制剂用于细胞模型,以验证分子间和信号通路上下游调节关系。结果:1.JWA基因在胰腺癌组织中低表达。对TCGA数据库中胰腺癌组织基因表达水平的分析发现:JWA在肿瘤组织中表达水平显著低于正常组织（P=0.022）。2.JWA Panc1 JWA达水平,减少Bxpc3细胞中JWA蛋白的表达水平,用划痕和穿孔实验检测JWA表达水平与细胞迁移的关系。划痕实验显示:与对照组相比,JWA高表达后,细胞迁移率减少52%;而JWA低表达后,细胞迁移率增加117%;穿孔实验显示:与对照组相比,JWA高表达后,穿孔细胞数减少35%,而JWA低表达后,穿孔细胞数增加44%。3.JAC4抑制胰腺癌细胞迁移。用0、0.1、1、10、50μM JAC4处理Panc1和Bxpc3两株胰腺癌细胞48 h后,免疫印迹实验证实JAC4能够提高JWA表达水平,且存在剂量-效应关系。JAC4对Panc1和Bxpc3两种胰腺癌细胞的48h半数抑制浓度（IC50值）分别为204和655μM。穿孔实验结果显示,与对照组相比,用JAC4 10μM处理48 h,两种胰腺癌细胞迁移能力均被抑制。与溶剂对照处理组相比,Panc1细胞迁移减少46%,Bxpc3细胞迁移减少32%。划痕实验结果显示JAC4 10μM处理48 h,Panc1和Bxpc3细胞迁移分别比溶剂对照组减少66%和35%。4.JAC4延长胰腺癌PDX模型小鼠生存时间并降低血清中LDH水平。构建4例人胰腺癌P3代组织NSG小鼠PDX模型,设溶剂对照、化疗药（吉西他滨+紫杉醇）阳性对照和JAC4处理三组。结果显示:干预3周后各组小鼠存活数分别为21/24,19/24和24/24;此外,血生化检测结果显示,与对照组相比,化疗药处理组和JAC4处理组模型小鼠血清中LDH水平均显著下降（3例组间差异较小的小鼠各组LDH均值分别是:885.78±231.63 U/L、630.75±137.89 U/L和579.2±112.86 U/L）。5.JWA对胰腺癌细胞能量代谢的影响。通过基因转染或用JAC4处理Panc1细胞48 h,增加胰腺癌细胞中JWA蛋白的表达水平,用Seahorse XF细胞外能量代谢分析仪检测JWA表达水平与细胞能量代谢的关系。结果显示:增加JWA表达水平,可提高肿瘤细胞的有氧呼吸（与对照组相比,基因转染和JAC410μM处理组基础呼吸分别增加1.55倍和3.22倍,ATP生成分别增加1.35倍和1.36倍,最大有氧呼吸分别增加2.05倍和2.64倍）。同时,抑制肿瘤细胞的糖酵解代谢（与对照组相比,JAC4 10μM处理组糖酵解与糖酵解能力分别抑制了21%和8%,基因转染对肿瘤糖酵解代谢影响不显著）。JWA表达水平与对能量代谢的作用存在剂量-效应关系。6.JWA增加胰腺癌细胞FOXO3a但抑制FAK的表达。通过基因转染或JAC4处理Panc1细胞48 h。免疫印迹结果显示:JWA表达水平升高,FOXO3a和p-FOXO3a的表达也相应增加;但FAK表达水平显著下降（分别下降了45%与49%）;在Bxpc3细胞中抑制JWA表达后,FOXO3a、p-FOXO3a表达水平也随之降低,而FAK表达水平升高了1.32倍。7.JAC4通过FOXO3a增加线粒体复合物Ⅲ表达,抑制胰腺癌细胞迁移。用基因转染或JAC4处理Panc1细胞48 h,提高JWA表达水平。免疫印迹结果显示:五种线粒体复合物中复合物Ⅲ（UQCRC2）表达水平明显增加（分别增加了1.42倍和1.54倍）,而这些处理对线粒体其它复合物表达水平的影响不明显。用JAC4处理Panc1细胞48 h后,再用复合物III抑制剂抗霉素A（500n M）处理1 h,穿孔实验结果显示:抑制剂处理后,穿孔细胞数增加了33%。用JAC4和FOXO3a si RNA处理Panc1细胞48 h后,再用复合物III抑制剂抗霉素A（500 n M）处理1 h。免疫印迹结果显示:JAC4和FOXO3a si RNA共处理比单纯JAC4处理,FAK表达水平增加3.04倍;但在JAC4和FOXO3a si RNA共处理或单纯JAC4 10μM处理基础上再用抗霉素A处理,FAK表达水平仅增加1.98倍。提示JWA对FAK的抑制作用是通过FOXO3a-线粒体复合物III途径实现的。8.JWA通过AMPK信号通路正调控FOXO3a表达。先用JAC4处理Panc1细胞48 h,再用10μM AMPK抑制剂复合物C处理6 h。免疫印迹结果显示:提高JWA表达水平后,FOXO3a,AMPK、p-AMPK的表达均随之增加,趋势均与JWA一致;而FAK和m TORC表达水平和趋势则与JWA相反。在JAC4处理基础上再用复合物C处理后,AMPK和p-AMPK表达水平下降,FOXO3a的表达被抑制,但FAK表达水平升高。穿孔实验结果显示,使用复合物C后,Panc1细胞迁移数增加。说明复合物C有效抑制了AMPK及下游FOXO3a的激活,阻断了JAC4通过FAK对细胞迁移的抑制。9.JAC4抑制小鼠胰腺癌转移并降低血清中LDH水平。用Panc1细胞（5×105个/100μl PBS）经裸鼠尾静脉接种建立被动转移模型,设对照组和JAC4干预组。结果显示,对照组与JAC4处理组转移小鼠数分别为5/14,3/15,相较于对照组,JAC4处理组的肺转移灶面积/右肺面积降低了2.5倍,JAC4处理组相较于对照组乳酸脱氢酶水平下降（P<0.01）。结论:JWA通过AMPK信号通路正调控FOXO3a,激活胰腺癌细胞氧化磷酸化同时抑制其糖酵解,在抑制胰腺癌细胞迁移和转移中发挥了积极作用。研究结果为阐明JWA抑制胰腺癌细胞迁移和转移的分子机制提供了新的学术依据;也为发展以抑癌基因JWA为靶点的治疗胰腺癌转移新疗法提供了新的思路。