论文部分内容阅读
骨缺损是由于外伤、肿瘤、遗传等多种因素所致的一种常见疾病,目前治疗骨缺损的方法主要有自体骨移植、异体骨移植、组织工程技术、基因治疗法及生长因子辅助治疗等。由于各种方法存在不同程度的局限性,且学界对其治疗缺乏统一性,所以骨缺损已成为骨科治疗的难题之一。促红细胞生成素(EPO)作为一种临床中治疗贫血的药物,目前被发现具有抗凋亡、抗炎、组织保护等多种非造血功能。最新发现,EPO还能够促进骨折的愈合,但其具体的作用机制尚不明确。目前认为,EPO促进骨折愈合可能的机制有以下两个方面:第一,EPO可以作用于成骨及破骨细胞,从而直接的促进骨折的愈合;第二,EPO作为一种强大的抗炎、抗凋亡、组织保护因子,能够在骨折愈合的过程中减轻炎症反应,保护与骨形成、骨折愈合相关的细胞、组织,从而间接地加快了骨折愈合的过程。目的:通过EPO对成骨细胞、骨髓间充质干细胞作用的实验研究,探讨EPO对骨形成的作用及机制,并间接地证明EPO促进骨折愈合的机制,从而为骨损伤修复的治疗提供新的方法。方法:实验主要是研究EPO对于C3H10T1/2(鼠的间充质干细胞)细胞系及ROS(鼠的骨肉瘤细胞)细胞系的作用。实验共分为四组,分别为10T1/2组和ROS组(加入含10%FBS的DMEM培养基,100U/L青霉素,100U/L链霉素)及10T1/2组和ROS组(加入含10%FBS的DMEM培养基,50μmol/L维生素C,10mmol/L β-甘油磷酸,100U/L青霉素,100U/L链霉素)。每天更换培养基并在各组给予不同浓度的EPO(0.3,3,30,100,300U/L),分别在第2,4,8天进行形态学观察,碱性磷酸酶染色或Von-kossa染色。结果:成骨细胞的形态学观察:刚刚传代的ROS细胞,由于尚未贴壁生长,光镜下呈球形;于37℃细胞培养箱内培养一天后,观察细胞已经贴壁,形态呈梭型或三角形,并带有多个突起。培养两天后,细胞可铺满整个6孔培养板,呈半融合。给予EPO后第四天,细胞融合成片,互相重叠呈铺路石状,部分成骨细胞相互聚集,形成不透光的矿化结节。给予EPO后第八天,矿化结节数量增多,细胞层叠生长并出现生长抑制,部分细胞死亡。骨髓间充质干细胞的形态学观察:C3H10T1/2细胞刚刚传代后,在倒置显微镜下观察呈球形。于37℃细胞培养箱内培养一天后,细胞已经贴壁生长,呈圆形、梭型、多角形,排列稀疏。给予EPO后第三天,细胞排列呈旋涡状或束状,均匀的铺满孔板。给予EPO第四天,细胞排列紧密,部分细胞形态转为三角形,未见矿化结节。给予EPO后第八天,三角形细胞比例逐渐增多,仍无矿化结节,细胞出现生长抑制,部分细胞死亡。碱性磷酸酶染色:在给予EPO第二天后的碱性磷酸酶染色中,ROS组无论是在普通培养基还是在分化培养基中,不同浓度的EPO(0.3、3.0、30、300U/L)与对照组间均无显著差异,且ROS普通组与ROS分化组之间的亦无显著差异。C3H10T1/2组在两种培养基中,不同浓度的EPO(0.3、3.0、30、300U/L)与对照组间无显著差异,且C3H10T1/2普通组与C3H10T1/2分化组之间的亦无显著差异。Von-kossa矿化结节染色:在给予EPO后第四天、第八天,分别对ROS分化组、C3H10T1/2分化组2组细胞进行Von-kossa矿化结节染色。给药后第四天,ROS组与C3H10T1/2组均未见矿化结节着色。在给药后第八天,ROS组各孔中均出现矿化结节着色,且无显著差异。而C3H10T1/2组培养板的各孔中仍未见矿化结节着色。结论:EPO对成骨细胞及骨髓间充质干细胞的增殖、分化及成熟无明显促进作用。EPO促进骨折愈合的机制仍待进一步证明及研究。