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原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其中绝大多数为肝细胞癌(Iaepa，tocelluIar carcinoma，HCC)。近半个世纪以来，随着医学物理学、影像学、麻醉学、免疫学、分子生物学的不断发展及外科技术的日益成熟，我国原发性肝癌的治疗取得了很大的进展，手术切除率、术后生存率及术后生活质量均有较大提高，尤其是进入20世纪90年代以后，以外科手术切除治疗为主包括放疗、化疗、和免疫治疗的综合治疗观念已占主导地位，然而较高的术后复发率仍是影响肝癌预后的最主要因素，肝癌根治性切除术后的5年复发率仍超过60％，即使小肝癌切除后其复发率也高达40％以上。随着分子生物学和免疫学的研究进展，肿瘤的生物治疗展现出美好的应用前景而成为肿瘤学研究的热点，并被称为继手术、化疗、放疗之后的第四种治疗模式。
随着抗原呈递和免疫识别的研究进展，树突状细胞(dendritic cells，DCs)在免疫反应中的核心作用逐渐为人们所认识。肿瘤免疫治疗是通过激活机体的免疫系统来清除肿瘤细胞，其关键是产生肿瘤特异的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CT、Ls)。研究表明：有效的抗肿瘤CTLs应答需要专职抗原呈递细胞(antigen presenting cells，APC)——树突状细胞(DCs)来激活T淋巴细胞。DCs在激活抗原特异性T淋巴细胞及维持T淋巴细胞活性方面具有重要作用，它是目前发现的唯一能激活未致敏T细胞(naive T cells)的APC，它能有效地刺激幼稚T细胞增殖，并建立初级免疫反应，同时产生免疫记忆。近年来，随着DCs疫苗抗瘤作用研究的开展，DCs已成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一。研究者运用各种形式的抗原修饰DCs(肿瘤细胞裂解物、溶解病毒或肿瘤蛋白、多肽、DNA或RNA等)，再将经过修饰的DCs回输入动物模型或人体内，取得了较好的抗瘤效果。本实验拟分离、培养健康人外周血单核细胞来源的DCs，应用多细胞因子鸡尾酒法诱导其成熟并负载经热休克处理后的肝癌细胞冻融抗原，探讨其诱导、活化肝癌特异性T淋巴细胞的作用。
研究目的
1．探索肝癌树突状细胞瘤苗的制备方法。
2．探讨肝癌树突状细胞瘤苗诱导AFP特异性T淋巴细胞应答的作用。
材料与方法
1．DCs的分离、培养及肝癌树突状细胞瘤苗的制备抽取10例健康自愿者外周血，分离单个核细胞(peripheral blood mononu． clear cells，PBMCs)，用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基悬浮并接种于25cm培养瓶，置于37℃培养箱中贴壁2h后，洗去非贴壁淋巴细胞培养备用，将贴壁单个核细胞以GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(500U/ml)诱导为未成熟DCs，第6天分组诱导成熟，A：对照组，仅用GM-CSF和IL-4培养；B：冻融抗原负载诱导组，加入AFP阳性肝癌细胞株Bel-7402的热休克冻融抗原；C：鸡尾酒法诱导组，加入细胞因子组合(1000U/mlTNF-α、10ng/mlIL-6、10ng/mlIL-1β、1μg/ml PGE2)诱导成熟；D：肝癌细胞热休克冻融抗原负载+鸡尾酒法诱导组。各组均在诱导24小时后收获DCs，流式细胞仪进行细胞表型分析，荧光标记观察CDS0、CD83、CD86、HLA-DR的表达。
2．成熟DCs体外诱导T淋巴细胞活化的ELISPOT检测我们采用ELISPOT技术检测成熟DCs刺激T淋巴细胞活化的活性，按照试剂盒的说明操作，将T细胞分别与不同的刺激物种植于ELISPOT专用的捕捉抗体包被的96孔板内，分组如下，A：阴性对照组，仅加入RPMI 1640完全培养基；B：加入鸡尾酒法诱导成熟的DCs；C：加入肝癌细胞热休克冻融抗原负载+鸡尾酒法诱导成熟的DCs；D：阳性对照组，加入10ul植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)。各组均置于37℃、5％CO2共孵育24-48小时。显色后所得斑点即代表分泌细胞因子的细胞数，用酶联免疫斑点图像自动分析仪(Bioreader 4000，德国BIOSYS公司)分析。 3．抗原负载的DCs体外诱导特异性抗肝癌CTLs的检测取HLA-A2阳性自愿者自体非贴壁细胞淋巴细胞作为效应细胞，按1：10比例加入诱导成熟的DCs，实验分组如下，A组：加入经鸡尾酒法诱导成熟的DCs；B组：加入经鸡尾酒+肝细胞癌热休克冻融抗原诱导成熟的。DCs。两组均于共培养5天后收获细胞，应用DimerX技术检测各组中特异性抗肝癌CTLs的百分率。
4．成熟DCs体外诱导T淋巴细胞增殖的检测取经荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,6-carboxynuorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)标记后的人同种异体淋巴细胞作为效应细胞，成熟DCs作为刺激细胞，分组培养，A组：对照组，加入等体积完全培养基；B组：实验组，按1：10比例加入经鸡尾酒法诱导成熟的DCs；C组：按1：10比例加入经肝细胞癌热休克冻融抗原负载+鸡尾酒法诱导成熟的：DCs。各组均于共培养3天后收获，应用流式细胞仪技术检测淋巴细胞的增殖情况。
实验结果
1.DCs成熟表型的荧光染色观察荧光显微镜观察可见CD80、CD83、CD86、HLA-DR均分布于细胞膜上，荧光双染可见细胞膜呈橙色荧光。
2．DCs成熟表型的检测B组、C组、D组的成熟表型CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达与A组相比均有明显提高(P<0.05)，其中，C组和D组又较B组显著提高(P<0.05)，但C组与D组相比无显著性差异(P>0.05)。
3．成熟：DCs诱导T淋巴细胞活化的ELISPOT检测平均每1×10<5>个淋巴细胞可检测到的分泌IFN-γ的斑点数分别为A组10、B组102、C组106、D组365，结果说明成熟DCs能够有效地激活T淋巴细胞并使其分泌INF-γ。
4．抗原负载的DCs体外诱导特异性抗肝癌CTLs的检测未负载热休克冻融抗原组诱导的CD8+的CTL平均结合表位肽A、B DimerX复合物的阳性细胞数分别为0.042％和0.045％；负责热休克冻融抗原组诱导的CD8+的CTL结合表位肽A、B DimerX复合物的阳性细胞数分别为1.06％和1.12％，明显高于未负载热休克冻融抗原组(P<0.05)。
5．成熟DCs体外诱导T淋巴细胞增殖的检测B组和C组分别有26.35％和28.52％的细胞发生分裂，其中分别有8.46％和10.18％分裂3-5次，与A组的11.23％和1.46％相比有显著性差异(P<0.05)。结果表明，成熟DCs体外能够有效地诱导T淋巴细胞分裂增殖。
结论
1．联合多细胞因子的鸡尾酒法可以高效诱导人单核细胞来源的DCs成熟。鸡尾酒法由多种常用的细胞因子组成，如果联合使用治疗级无血清培养体系，可以满足临床制备DCs瘤苗对安全性、有效性和质量控制的要求。
2．负载肝细胞癌热休克冻融抗原的DCs瘤苗体外能够有效地激活T淋巴细胞，促进其分裂增殖，并增强其分泌IFN-γ的能力。
3．本研究制备的肝癌DCs瘤苗体外可诱导出针对多个AFP HLA-A2限制性表位肽的特异性CTLs，说明该瘤苗可以激发特异性的抗肝癌免疫应答。