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近些年来,研究发现一些存在于环境中的化学物质具有类似内分泌激素的作用,可以导致生物体内分泌系统紊乱,因此将这类物质统称为环境激素(Environmental Endocrine, EE)。EE在环境中分布广泛且多为脂溶性的有机小分子,化学性质特别稳定,在体内和体外都不易分解,通过食物链进入生物体内后,可蓄积于脂肪组织内,从而对人和其他生物体的生殖与发育系统、免疫系统及神经系统等造成伤害。目前,EE已威胁到人和动物的生殖健康甚至物种的繁衍。为了保护生态环境,预防环境激素污染物(Environmental Endocrine Pollutants, EEP)通过食物链进入人体,发展灵敏、快速及成本低的分析检测技术是非常必要的。目前,EEP主要使用GC-MS、HPLC及LC-MS来进行分析与确证,但是存在样品前处理过程复杂、操作繁琐、仪器昂贵、检测成本偏高等缺点,不能很好地满足日常分析及现场检测的需求。而免疫学方法由于具有灵敏度高、特异性强、操作方便和成本低等优点,已被应用于EEP的日常分析检测,特别适用于对大量样品进行分析筛选。然而目前多数免疫分析方法通常一次实验仅能分析一种EEP,而样品中往往是同时存在多种EEP。因此发展效率更高的能对样品中的多种EEP同时分析的免疫学方法是目前拟解决的关键问题。本研究以双酚A(Bisphenol A,BPA)、2,4-滴(2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4-D)及毒死蜱(Chlorpyrifos, CHI)三种典型的EEP为分析对象,在构建BPA、2,4-D与CHI完全抗原与制备抗BPA抗体的基础上,采用Luminex技术建立了能同时分析上述三种EEP的LIA,并与酶联免疫吸附检测方法(ELISA)和HPLC进行了比较分析。具体的研究内容如下。1.完全抗原的制备本研究采用活性酯法分别制备BPA、2,4-D及CHI的完全抗原偶联物。经质谱分析表明BVA-BSA、2,4-D-BSA及CHI-BSA的摩尔偶联比分别为15：1、22：1和11：1。另外首次采用Mannich法将BPA与阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)偶联,构建了完全抗原BPA-cBSA,产物经质谱分析其摩尔偶联比为14：1。2.BPA抗体的制备以BVA-BSA和BPA-cBSA分别免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,完全抗原均能有效地产生抗BPA的抗体,BPA-cBSA组抗血清效价高于BVA-BSA组。上述结果表明,小鼠对BPA-cBSA的免疫应答水平显著高于BVA-BSA。3.BPA、2,4-D及CHI的ELISA研究3.1间接竞争ELISA以上述自制的抗BPA抗体与购买到的抗2,4-D及CHI抗体为材料,分别建立了检测BPA、2,4-D与CHI的间接竞争ELISA,绘制它们的ELISA标准曲线,其线性范围分别为40～1289、34～1914与38-234 ng/mL,半抑制率(IC50)分别为177、366及108ng/mL,最低检出限(LOD)分别为16、3与8 ng/mL。将不同浓度的BPA(400、100和25 ng/mL)、2,4-D(800、200和50 ng/mL)及CHI(200、100和50 ng/mL)分别添加于空白的自来水和河水中,BPA、2,4-D与CHI的平均加标回收率分别为68%～142%、55%～135%及90%～108%,平均变异系数分别为6%～15%、6%～14%及3%～12%。3.2 BPA的半抗原直接包被ELISA研究在建立了检测BPA的间接竞争ELISA的基础上,建立了检测BPA的半抗原直接偶联ELISA (dhc-ELISA),绘制其dhc-ELISA标准曲线,其线性范围为2-157ng/mL, IC50及LOD约为23.5及0.3 ng/mL。将不同浓度的BPA(250、50和10 ng／mL)分别添加于空白的自来水和河水中,以建立的dhc-ELISA进行检测,结果显示平均回收率与平均变异系数分别为60%-132%及6%-13%。4.BPA、2,4-D及CHI的液相芯片技术研究经条件优化后,分别绘制了BPA、2,4-D和CHI的间接竞争Luminex标准曲线,检测区间分别为0.8～246.1、5.4～391.1及14.2-364.9 ng/mL,IC50值分别为30.8、64.0及98.3 ng/mL,LOD值分别约为0.03、0.35及0.16 ng/mL。在建立了检测三种靶标物的Luminex方法的基础上,为了全面考察液相芯片多通道检测实际样品的能力,添加BPA(10、50及150 ng/mL)、2,4-D(20、100及300 ng/mL)及CHI(30、150及450 ng/mL)标准品于空白的河水或自来水中分别配制成18种不同组份样品。结果表明,当样品中仅含有一种靶标物时,BPA、2,4-D及CHI在水样中的平均加标回收率分别为41%～132%、64%～147%及52%～109%,平均变异系数分别为0.8%～8.7%、0.3%～9.6%及1.7%～8.8%。当样品中两种靶标物同时存在时,BPA、2,4-D及CHI在水样中的平均加标回收率分别为52%～123%、51%～121%及64%～97%,平均变异系数分别为0.9%-9.9%、0.6%-6.0%及0.8%-5.8%。当样品中三种靶标物并存时,BPA、2,4-D及CHI在水样中的平均加标回收率分别为43%～66%、62%～112%及51%～68%,平均变异系数分别为3.2%-5.5%、1.1%～9.3%及2.2%～7.1%。上述结果表明Luminex法能够较好对样品的多靶标物进行同时分析。