妊娠期猪胚胎/胎儿死亡会导致产仔数降低,而胎儿宫内发育迟缓会造成低初生重仔猪数目增加,这些低出生重的仔猪对疾病的抵抗能力及饲料利用率均降低,因此,严重影响母猪的繁殖效率。胚胎的附植及胎盘的建立和发育直接影响着胎盘效率,是成功妊娠的重要过程。胎盘的大小及转运功效决定了胎盘效率的高低,在附植前期及附植期,猪孕体滋养层会经历一个形态迅速重塑的过程,其形态从球形(约10mm)逐渐转变为线状(约150mm),滋养层扩张重塑的目的是在子宫中占据足够的位置进行附植,因而也决定了胎盘的大小。随后孕体滋养层上皮细胞与子宫内膜上皮细胞粘附形成上皮绒毛膜型胎盘,建立母体与胎儿之间的转运通道。因此本研究首先以滋养层快速重塑的球形和线形孕体为材料,通过差异表达基因的筛选,检测与猪胚胎附植及胎盘建立相关的基因及调控通路。其次,从差异表达基因中选取PLET1基因为候选基因,研究该基因在胎盘建立及发育中的调控机制,研究结果如下:1.通过芯片杂交分析分别筛选到梅山和大白猪的球形和线状孕体中的差异表达基因,对比发现只在大白猪中上调表达的基因有410个,下调表达的基因有634个。只在梅山猪中上调表达基因288个,下调表达基因292个。因此,大白猪孕体中的差异表达基因远多于梅山猪,即梅山猪孕体在附植前期的基因表达更趋于平稳。此外,两个品种中共同上调表达基因有345个和共同下调表达基因有379个,推测这些基因可能是调控孕体发育所必需的基因。对差异表达基因进行功能分类和信号通路分析,发现两个品种猪孕体中差异表达基因均涉及与血管生成、激素应答、细胞增殖等,说明这些过程是孕体延长所必需的,同时也发现只在梅山猪孕体中差异表达基因涉及的信号通路主要是与细胞外基质作用、胺类生物合成、黏着斑等少数信号途径,而只在大白猪孕体中差异表达基因则涉及激素合成、补体系统、粘多糖降解、钙离子信号途径等多个信号通路,也说明大白猪孕体在延长过程中基因表达变化可能会引起细胞的许多功能发生改变。2.PLET1是一个在形态重塑期的梅山猪和大白猪孕体中均上调表达的基因,推测其表达可能对孕体滋养层的延长是必要的。我们首先检测PLET1基因的表达模式,发现PLET1在囊胚期表达量较低,而在附植后直到整个妊娠末期表达量迅速上升,验证了PLET1基因是一个胚胎延长期的差异表达基因,并且发现PLET1基因在猪胎盘发育过程中也是上调表达,说明其可能也参与胎盘的发育过程。3.对猪PLET1基因的进一步研究发现:(1)通过原位杂交及免疫荧光检测到PLET1只在孕体和胎盘滋养层细胞表达,证明其可以作为胎盘中滋养层细胞的标记基因,用于滋养层细胞的分选。(2)PLET1在妊娠不同时期的滋养层细胞中的表达定位也发生变化,即从妊娠50天开始,随着胎盘褶皱的形成和进一步发育,PLET1蛋白逐渐向滋养层细胞顶端聚集,表达位置进一步贴近母体子宫内膜上皮细胞,推测PLET1可能影响滋养层细胞与母体子宫内膜细胞的相互作用。(3)通过3′RACE技术鉴定到猪胎盘中表达3′UTR长度不同的两个转录本,证实这两个转录本是由于选择性加尾信号导致的,并且荧光定量分析结果显示,两个转录本的表达量比值随着妊娠的进程而改变,说明虽然这两个转录本编码相同的蛋白质,但是它们在胎盘的发育过程中发挥的功能可能并不完全相同。(4)在体外细胞中的研究发现PLET1基因的长转录本表达活性更高,并且PLET1的表达受mi R-181a、mi R-181c和mi RNA-365-3p的调控。4.对PLET1蛋白进行氨基酸序列分析,预测其可能存在N-连接的糖基化修饰,经蛋白质糖基化检测发现PLET1蛋白在胎盘中主要是以糖基化形式存在。5.荧光定量检测结果发现Plet1基因在体重不同的小鼠胎儿的胎盘中差异表达,进一步利用TALEN基因敲除技术构建了Plet1基因敲除小鼠,发现Plet1基因敲除小鼠的胎盘迷路层面积增大,连接层结构变得致密;迷路层血窦面积变小而血细胞含量增多,因此从小鼠个体水平检测到Plet1可能与胎盘的发育有关。