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目的：以PD-1/PD-L1抗体为代表的肿瘤免疫治疗有效提高了黑色素瘤、非小细胞肺癌和肝癌等多种肿瘤患者的预后。研究表明PD-1/PD-L1抗体的有效性与肿瘤细胞表面PD-L1的表达密切相关。本研究的目的是构建PD-L1的重组真核表达载体，研究RNF125与PD-L1相互作用及这种相互作用对PD-L1的表达的影响，并进一步研究RNF125调控PD-L1的分子机制。 方法：1、通过重组PCR方法，将PD-L1的cDNA插入到pCMV-Myc-Vector和pCMV-HA-Vector中，构建pCMV-Myc-PD-L1和pCMV-HA-PD-L1重组真核表达载体。 2、通过免疫印迹及免疫共沉淀方法，研究RNF125与PD-L1的相互作用及这种相互作用对PD-L1蛋白表达量的影响。 3、通过RT-PCR及免疫印迹方法，研究在IFN-γ刺激下RNF125对人肝癌HepG2细胞中PD-L1表达的调控作用。 4、通过泛素化实验，研究RNF125调控PD-L1发生泛素化的结构域及泛素化的形式。 结果：1、将酶切后的目的基因与空载体连接起来，再经转化、涂板、挑单克隆后进行RCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示在750bp～1000bp的位置可见目的条带。选取插入目的基因的细菌克隆菌液进行测序，结果显示阳性菌液的测序结果与NCBI数据库中人PD-L1基因序列完全一致。将重组质粒转化到293T细胞中，通过免疫蛋白印迹在35Kd的位置可见到目的条带，表明PD-L1的重组真核表达载体构建成功。 2、将Flag-RNF125与Myc-PD-L1共转染至293T细胞中，通过免疫共沉淀，发现Flag-RNF125可与Myc-PD-L1发生相互作用，将浓度依次增加的Myc-RNF125与HA-PD-L1共转染至293T细胞中，通过免疫印迹实验，发现Myc-RNF125可以下调HA-PD-L1的表达，并呈剂量依赖性，表明RNF125可与PD-L1相互作用并下调PD-L1的表达。 3、通过过表达或RNAi技术，上调或下调人肝癌HepG2细胞中RNF125的表达，采用RT-PCR和免疫印实验，与对照组相比，过表达RNF125可以促进HepG2细胞中IFN-γ引起的PD-L1的表达水平下调，而敲低RNF125可以促进HepG2细胞中IFN-γ引起的PD-L1的表达水平上调，表明RNF125可能通过调控PD-L1参与肝癌肿瘤免疫。 4、将RF125(WT或C72，75A)、Ub(WT,K48only或K63only)、PD-L1共转染至293T细胞中，通过泛素化实验发现RNF125可以使PD-L1发生K48位连接形式的泛素化修饰，而Ring结构域突变的RNF125则不影响PD-L1的泛素化水平，表明RNF125通过K48位形式的泛素化修饰PD-L1从而参与肿瘤免疫。 结论：本研究成功构建了PD-L1的重组真核表达载体，并发现RNF125可以与PD-L1发生相互作用降低PD-L1蛋白的稳定性;进一步研究发现，RNF125能够使PD-L1发生K48连接形式的泛素化，而RNF125泛素化酶活性缺失突变体则丧失了这样的功能。