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第一部分:AKBA抑制钛颗粒诱导假体周围骨溶解的研究目的:探讨AKBA抑制钛颗粒诱导假体周围骨溶解的治疗作用。方法:选取56只雄性C57BL/J6小鼠,随机分为4组:对照组(Control组),Ti颗粒组(Ti组),AKBA低剂量治疗组(L-AKBA组)和AKBA高剂量治疗组(H-AKBA组),每组14只小鼠。Control组仅施行手术,在小鼠颅骨正中矢状缝处做一切口后随即缝合,术后每天向小鼠腹腔内注射等量的无菌PBS溶液;Ti组在小鼠颅骨表面植入Ti颗粒,术后每天向小鼠腹腔内注射等量的无菌PBS溶液;LAKBA组和H-AKBA组,在Ti颗粒植入后,分别每天向小鼠腹腔内注射AKBA7.5mg/kg和15mg/kg。两周后采用脱颈法处死小鼠,收集颅骨和血液,分别行Micro-CT、H&E染色、TRAP染色、ELISA试验、RT-PCR、血常规和生化等检测。结果:Micro-CT结果显示L-AKBA组和H-AKBA组颅骨的骨溶解反应明显减轻,颅骨表面陷窝数和表面陷窝面积分别与Ti组比较明显减少,骨密度和骨体积分数分别与Ti组比较明显增加(p<0.05)。H&E染色结果显示Ti组骨膜内有大量的多核巨噬细胞形成,L-AKBA组和H-AKBA组的炎症反应明显减轻,矢状缝骨吸收面积与Ti组比较明显减小,颅骨厚度与Ti组比较明显增加(p<0.05)。TRAP染色结果显示Ti组在颅骨溶解的边缘侧可见大量TRAP阳性细胞,L-AKBA组和HAKBA组TRAP阳性细胞的数量显著减少,Oc S/BS分别比Ti组降低了35.3%和70.6%(p<0.05)。RT-PCR结果显示,Ti组的破骨细胞相关基因TRAP、Cath-K、CTR和OSCAR的m RNA表达显著上调,L-AKBA组和H-AKBA组上述相关基因的m RNA表达水平与Ti组比较均明显下调(p<0.05)。ELISA结果显示Ti组颅骨体外培养上清液中TNF-α,IL-1β和IL-6的表达明显升高,L-AKBA组和H-AKBA组上述炎症因子的表达水平均明显下降,且抑制作用呈剂量依赖性(p<0.05)。而血常规和生化结果显示L-AKBA组和H-AKBA组的血红蛋白,白细胞,血小板,丙氨酸转氨酶,天冬氨酸转氨酶,尿素氮和肌酐的含量分别与Ti组比较无明显差异(p>0.05)。结论:AKBA能够以剂量依赖的方式抑制Ti颗粒所诱导的炎性因子的分泌来减轻慢性炎症反应,抑制破骨细胞相关基因的表达来减少破骨细胞的分化形成,减少骨丢失,增加骨质含量,从而达到预防和治疗磨损颗粒所诱导的骨溶解反应。第二部分:AKBA对RANKL诱导破骨细胞分化的影响目的:进一步明确AKBA对RANKL诱导破骨细胞分化的抑制作用。方法:以骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)为研究对象,观察AKBA对RANKL(50ng/ml)诱导破骨细胞活化的影响。使用CCK8试验来进行细胞增殖和毒性分析;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色来检测成熟的破骨细胞数量;骨板吸收实验来检测破骨细胞的骨吸收能力;鬼笔环肽染色来检测F-肌动蛋白环的形成情况;RT-PCR检测破骨细胞相关基因TRAP、Cath-K、CTR、OSCAR、NFATc1、MMP-9的m RNA表达水平,以及TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的m RNA表达水平。结果:CCK8试验结果表明当AKBA的浓度小于30μM时对BMMs细胞的增殖无明显影响,对细胞没有任何毒性作用。TRAP染色结果显示:Control组可见大量紫红色的多核巨噬细胞,而AKBA组随着浓度的增加,巨噬细胞的数量逐渐减少;统计分析结果表明AKBA组TRAP阳性细胞数量和面积与Control组相比明显减少,呈浓度依赖性,差异有统计学意义(p<0.05)。骨板吸收实验结果显示:Control组有明显的骨吸收陷窝形成,骨吸收面积比高达73.4%,而AKBA组骨吸收陷窝面积随着药物浓度的增加而逐渐减少;统计分析结果表明AKBA组骨吸收面积比(%)与Control组比较明显减少,呈浓度依赖性,差异有统计学意义(p<0.05)。鬼笔环肽染色结果显示:Control组可清楚地观察到破骨细胞分化良好的F-肌动蛋白环。而AKBA组随着浓度的增加,F-肌动蛋白环的大小和数量均明显地减少。RT-PCR结果显示:随着AKBA浓度的增加,破骨细胞相关基因TRAP、Cath-K、CTR、OSCAR、NFATc1和MMP-9的m RNA表达与Control组比较逐渐下调;TNF-α,IL-1β和IL-6等炎症因子的m RNA表达水平也逐渐下降(p<0.05)。结论:在体外细胞培养中,AKBA在一定浓度范围内能够以浓度依赖的方式抑制炎性因子的表达来减轻慢性炎症反应,抑制破骨细胞相关基因的表达来减少破骨细胞的分化形成,破坏F-肌动蛋白环,减少破骨细胞性骨吸收。第三部分:AKBA抑制破骨细胞分化的机制研究目的:进一步明确AKBA抑制破骨细胞分化的具体信号通路和靶点位置。方法:以小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,观察AKBA对RANKL诱导破骨细胞活化的影响。采用Western blot实验测定IκBα,p-IκBα,p65,p-p65,ERK,P-ERK,JNK,p-JNK,p38,p-p38,AKT1,p-AKT1,MEK,p-MEK,NFATc1,c-Fos的表达情况,并测定相对灰度值。RT-PCR检测NFATc1和c-Fos的m RNA表达水平。结果:随着时间的推移,AKT,IκBα,p65,JNK和p38的磷酸化水平没有被AKBA所抑制,其相对灰度值AKBA组与Control组比较无明显差异(p>0.05);随着时间的推移,ERK的磷酸化水平逐渐地被AKBA所抑制,其15分、30分、60分的相对灰度值AKBA组比Control组明显下降(p<0.05);随着AKBA浓度的增加,ERK的磷酸化水平也逐渐减少,当AKBA 15μM时ERK的磷酸化水平几乎完全被抑制了,AKBA 0.1μM、1μM、15μM时的相对灰度值与0μM组比较明显降低(p<0.05);随着时间的推移,上游因子MEK的磷酸化水平没有被AKBA所抑制,相对灰度值AKBA组与Control组比较无明显差异(p>0.05);下游通路因子c-Fos和NFATc1的磷酸化水平逐渐被AKBA所抑制,第一天和第三天的相对灰度值与Control组比较明显下降(p<0.05),且c-Fos被抑制的程度要比NFATc1大。RT-PCR结果显示,随着AKBA浓度的增加,NFATc1和c-Fos的m RNA表达与Control组比较逐渐下调(p<0.05)。结论:AKBA主要通过抑制MAPK通路中的ERK信号通路及其下游通路因子(包括c-Fos和NFATc1)来调节RANKL诱导的破骨细胞的分化形成及其相关基因的表达。抑制ERK的磷酸化是AKBA作用的靶点位置,这些信号通路之间具有相互协同或抑制的作用。