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目的将能够在细胞内非分泌表达Aβ1-42的逆转录病毒导入人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH中,进行细胞内非分泌表达Aβ1-42所致细胞毒作用的研究,以验证阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）的细胞内中毒学说。为其发病机制的研究以及进一步建立AD细胞内中毒的细胞模型和动物模型创造有利条件。方法1.用非对称互补引物/模板法,制备两端含有酶切位点的Aβ1-42的cDNA,将其重组于pGEM-T Easy质粒中,筛选得到含有Aβ1-42基因的克隆。并用Sanger单链末端终止法测出全部的核苷酸序列,比较该序列与GenBank所报道的结果。2.经鉴定正确的pGEM-T Easy / Aβ1-42克隆和逆转录病毒载体pLxsn,分别用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳回收基因片段及线性化载体。用T4 DNA连接酶连接两个回收片段,构建重组质粒pL–Aβ1-42–sn。限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。3.将经鉴定正确的重组质粒pL–Aβ1-42–sn、逆转录病毒载体pLxsn和pL-EGFP-sn分别转染80%融合的PA317包装细胞系,培养3天后收获上清,其中含有较高滴度的重组病毒。4.复苏并培养人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH,采用反复感染法分别用含有目的基因的重组逆转录病毒、空病毒和报告病毒感染SK-N-SH细胞。通过报告基因EGFP利用流式细胞术分析检测目的基因在靶细胞内的表达和转染效率。通过免疫组化方法观察Aβ1-42在人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH内的非分泌表达情况。5.进行实验分组,用Aβ1-42病毒液转染人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH作为Aβ1-42转基因组,逆转录病毒载体pLxsn病毒液转染人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH作为空病毒对照组,人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH作为正常对照组,通过形态