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伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性菌,该病原菌感染会引起炎症综合反应,其特征是被感染部位炎性细胞因子大量增加。三结构域蛋白/三基序蛋白21（Tripartite motif protein 21,TRIM21）作为E3泛素连接酶蛋白,在炎症调节中起关键作用。TRIM21可以催化Lys63（K63）连接的泛素链形成,并刺激NF-κB信号通路以及AP-1、IRF3、IRF5和IRF7等转录因子,从而导致促炎细胞因子的产生。目前,关于TRIM21应答病原体感染的研究主要集中在其应对病毒感染的细胞内反应。然而,TRIM21在细菌感染,尤其是革兰氏阳性菌感染中的调节作用研究仍较少。因此,本试验在检测伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞TRIM21表达的基础上,进一步以C57BL/6野生型（WT）和TRIM21敲除(Trim21-/-)小鼠及其腹腔巨噬细胞为对象,研究TRIM21在小鼠应答伪结核棒状杆菌感染致炎中的作用,主要研究内容及结果如下:1.伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞对TRIM21表达的影响用伪结核棒状杆菌标准株（ATCC19410）感染WT小鼠腹腔巨噬细胞,Quantitative Real-time PCR（qPCR）检测细胞中Trim21、Trim27、Trim30a和Trim45的mRNA表达水平,Western blot检测细胞裂解沉淀中TRIM21的蛋白表达水平。结果显示,伪结核棒状杆菌感染细胞6、12和18 h,均引起Trim21和Trim30a的mRNA表达水平显著上调,而Trim27和Trim45的mRNA表达水平下降;在感染细胞12和18 h后,TRIM21蛋白表达水平与mRNA表达水平一致,均显著高于未感染巨噬细胞。为研究磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）对伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞中TRIM21表达的影响,用该病原菌标准株（ATCC19410）、临床分离株（XH02）及其pld缺失株（ATCC19410Δpld、和XH02Δpld）分别感染WT小鼠腹腔巨噬细胞,qPCR检测Trim21的mRNA表水平,Western blot检测TRIM21的蛋白表达水平。结果显示,感染4 h后,ATCC19410Δpld和XH02Δpld感染巨噬细胞中TRIM21的mRNA表达水平显著低于对应的ATCC19410和XH02感染细胞;感染18 h后,ATCC19410Δpld和XH02Δpld感染巨噬细胞中TRIM21的蛋白表达水平也略低于对应的ATCC19410和XH02感染细胞,无统计学显著差异。以上研究表明,伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞可引起TRIM21的表达增加,PLD部分参与了TRIM21表达的上调。2.TRIM21在伪结核棒状杆菌体外感染巨噬细胞致炎中的作用以伪结核棒状杆菌标准株（ATCC19410）感染或其培养上清液作用WT和Trim21-/-小鼠腹腔巨噬细胞,qPCR检测细胞中IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平,ELISA检测细胞上清中IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量。结果显示,与感染的WT小鼠腹腔巨噬细胞相比,除TNF-α的mRNA表达水平无显著性差异外,感染的Trim21-/-小鼠腹腔巨噬细胞IL-1α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平和分泌量均显著增加。为进一步确定TRIM21敲除对伪结核棒状杆菌在巨噬细胞中复制及引发细胞死亡的影响,用ATCC19410分别感染WT和Trim21-/-小鼠腹腔巨噬细胞,检测乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）释放水平以及胞内细菌数量。结果显示,伪结核棒状杆菌感染18 h后,Trim21-/-小鼠腹腔巨噬细胞释放的LDH水平显著高于WT小鼠腹腔巨噬细胞;此外,感染6 h后,感染的Trim21-/-小鼠腹腔巨噬细胞中伪结核棒状杆菌总数显著高于感染的WT小鼠腹腔巨噬细胞。以上研究表明,TRIM21负调节伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞中IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达和分泌,同时在限制伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞内该病原菌复制以及保护巨噬细胞免于死亡中发挥重要作用。3.TRIM21在伪结核棒状杆菌体内感染小鼠致炎中的作用为研究TRIM21在宿主抵御伪结核棒状杆菌感染中的作用,本研究从以下三个试验来验证。试验一,用伪结核棒状杆菌标准株（ATCC19410）腹腔感染WT和Trim21-/-小鼠,未感染组腹腔注射等量无菌生理盐水。感染小鼠12 h后,收集腹水和脏器通过标准平板计数法计算细菌数量。结果显示,伪结核棒状杆菌感染组Trim21-/-小鼠的肝、脾、肺、肾和腹水中的细菌数量分别比该病原感染的WT小鼠相对应器官和腹水高2.28、4.41、127.84、2.50和8.97倍;感染小鼠15天后,感染组Trim21-/-小鼠死亡率为100%（7/7）,显著高于该病原感染的WT小鼠（14.29%,1/7）。试验二,用含LB肉汤培养液的ATCC19410腹腔感染WT和Trim21-/-小鼠,未感染组小鼠注射等量无菌LB肉汤。ELISA检测小鼠血清、腹水及部分脏器中IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌量。结果显示,感染小鼠10 h后,感染组Trim21-/-小鼠的血清、腹水、肝、脾和肾中IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌量高于该病原感染的WT小鼠。试验三,用ATCC19410腹腔感染WT和Trim21-/-小鼠,未感染组腹腔注射等量无菌生理盐水。结果显示,感染小鼠72 h后,与感染组WT小鼠相比,在该病原感染Trim21-/-小鼠的肝脏中观察到更严重的坏死和变性区域,脾脏中观察到更为严重的淋巴细胞坏死,纤维蛋白渗出和中性粒细胞浸润,肺部出血区域严重,肾脏中肾小球严重肿大,整个肾小球遍布大量红细胞和纤维蛋白;感染小鼠15天后,感染组Trim21-/-小鼠比WT小鼠肾脏和肝脏的脓肿大且数量多。以上研究表明,TRIM21在宿主抵抗伪结核棒状杆菌感染致病中发挥重要作用。