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目的:PV-杀白细胞素(Panton-Valentine Leukocidin,PVL)是由金黄色葡萄球菌产生的细胞外毒素,是主要的致病因子。PVL对人和兔的多形核白细胞(PMNs)和巨噬细胞具有高度特异性,本课题目的:1、rPVL对THP-1巨噬细胞的细胞毒性研究;2、探讨rPVL对THP-1巨噬细胞NF-κB信号通路及炎性细胞因子表达的影响。 方法:(1)用不同浓度rPVL(1nM/L,5nM/L,10nM/L,20nM/L,40nM/L和80nM/L)作用THP-1巨噬细胞1,3,6h,CCK-8实验检测rPVL对THP-1巨噬细胞活力的影响。(2)5nM/L,20nM/L和40nM/LrPVL作用THP-1巨噬细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡/坏死率。(3)分别用不同浓度的rPVL(5nM/L,20nM/L)刺激THP-1巨噬细胞,于1,3,6h收集细胞培养上清,ELISA法检测细胞培养上清IL-6、IL-8和TNF-α的浓度变化。(4)20nM/LrPVL刺激细胞1,3,6h后,收集细胞,提取总RNA,应用RT-PCR法检测细胞IL-6、IL-8、TNF-α、TLR2、TLR4和CD14mRNA表达。(5)应用免疫细胞化学和Western blotting方法检测rPVL刺激THP-1巨噬细胞NF-κB的蛋白表达。(6)NF-κB阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)阻断NF-κB活化,RT-PCR法和ELISA法检测其对细胞因子表达的影响。 结果:(1)随着rPVL对THP-1巨噬细胞作用的浓度和时间的增加,细胞活性进行性下降。(2)rPVL作用THP-1巨噬细胞,流式细胞仪技术定量检测凋亡/坏死,在低浓度(5nM/L rPVL)以凋亡为主,在高浓度(40nM/L rPVL)以坏死为主,且具有时间依赖性。(3)ELISA法检测结果表明,rPVL能诱导THP-1巨噬细胞产生IL-8、IL-6和TNF-α,随着rPVL刺激浓度的增加和时间的延长,IL-8和IL-6表达增加;TNF-α的表达高峰在rPVL刺激1h时,随后逐渐降低。(4)免疫细胞化学方法检测结果显示:正常时,NF-κBp65蛋白在胞浆均匀分布,胞浆内呈棕色均匀淡染,rPVL刺激后2h,NF-κBp65被激活转入核内,染色以核明显。Western blotting方法检测结果表明,rPVL能直接诱导THP-1巨噬细胞迅速活化NF-κB蛋白,具有时间和浓度依赖性。(5)NF-κB阻断剂PDTC能够阻断NF-κB信号通路,抑制IL-6和IL-8蛋白分泌和mRNA的表达。 结论:(1)rPVL对THP-1巨噬细胞具有毒性作用,使细胞活力减低,低浓度可诱导细胞凋亡,高浓度可引起坏死。(2)rPVL能诱导THP-1巨噬细胞因子IL-6、IL-8及TNF-α的表达,同时,可上调TLR4表达,活化NF-κB,提示rPVL可通过TLR4/NF-κB信号传导通路,促进细胞因子的表达。(3)PDTC能抑制NF-κB通路,降低 IL-6和IL-8等炎性因子的表达。