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多年生黑麦草(Lolium perenne)是禾本科单子叶黑麦草属植物,是优良的牧草和草坪草,是温带地区分布最广的草种。在我国是引进栽培,种植和应用越来越广泛。低木质素含量黑麦草的培育,有利于提高饲草的利用率和消化率。
木质素(lignin)作为维管植物的重要成分之一,主要存在于细胞的次生壁中。然而,木质素却是许多工农业加工过程的限制因素,例如在化学制浆、牧草消化以及木质纤维转化为生物酒精等过程中。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)是催化木质素单体生物合成最后两步的关键酶。
本研究通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,将木质素合成关键酶基因CCR和CAD的RNA干扰(RNAi)片段引入黑麦草基因组,沉默目的基因表达,以获得低木质素含量的多年生黑麦草。研究获得如下结果:
1.构建了干扰黑麦草中CCR和CAD基因的植物表达载体p23-iCCR和p23-iCAD。根据NCBIGenBanK中黑麦草CCR和CAD基因序列,选取合适片段,设计特异引物并添加相应酶切位点,从野生型多年生黑麦草cDNA分离克隆CCR和CAD基因片段,分别构建了含正反方向目的片段的植物表达载体p23-iCCR和p23-iCAD。
2.获得了导入目的片段的转基因植株。通过根癌农杆菌EHA105介导,转化多年生黑麦草胚性愈伤组织,经巴龙霉素筛选和PCR检测,获得导入了干扰CCR和CAD基因片段的独立转基因i-CCR株系32株,i-CAD株系26株。
3.转基因植株目标靶基因CCR和CAD在转录水平上表达降低。半定量检测转录水平上的基因表达,结果显示,木质素含量降低的转基因植株中CCR和CAD基因在转录水平上均降低,CCR基因表达降低更加显著。
4.获得了木质素显著降低的转基因多年生黑麦草。常规比色法测定相对木质素含量,结果显示,与对照相比,转基因植株中,有9株i-CCR植株和11株i-CAD植株木质素含量显著降低。i-CCR植株木质素含量降低了28.58～50.18％,平均降低了34.67％;i-CAD植株木质素含量降低了26.40～45.04％,平均降低了33.86％。观察显示,转基因植株生长正常。
5.木质素含量降低的转基因植株,纤维素含量均有降低,降低程度不同。常规比色法测定相对纤维素含量,结果表明,与对照相比,木质素含量降低的转基因植株中纤维素含量均有所下降,9株i-CCR植株纤维素含量降低了16.01～28.59％,平均降低了23.12％,差异显著;9株i-CAD植株纤维素含量降低了1.58～18.31％,平均降低了9.90％,部分植株差异显著。
本研究表明通过干扰CCR和CAD基因表达,可以获得低木质素含量的多年生黑麦草,为进一步培育易消化吸收的黑麦草提供了良好的种质资源。