孙桂芝教授是著名的中西医结合肿瘤专家,从事临床肿瘤防治工作近60年,诊治中晚期肿瘤患者几十万人,尤以治疗消化道肿瘤而著称,运用“治未病”思想治疗肝纤维化/肝硬化、防治肝癌积累了丰富的临床经验。肝癌死亡率位居我国肿瘤死亡率第3位,并且肝癌发展迅速,患者生存期较短。我国是乙肝大国,“肝炎-肝纤维化/肝硬化-肝癌”是肝癌发展的3部曲,研究发现80%肝癌患者发病于肝纤维化,结合祖国医学“治未病”思想,孙桂芝教授认为对于肝癌的防治应当以防为主,防治结合,具体表现为：“未病先防”即防治肝纤维化/肝硬化：“既病防变”即积极治疗肝纤维化/肝硬化,防止向肝癌进展；“治病于初”,即积极治疗肝纤维化/早期肝硬化。本课题通过总结孙桂芝教授临床治疗肝纤维化/肝硬化经验,选取具有肝纤维化/肝硬化病史的原发性肝癌35例进行前瞻性临床研究,采用“无尺度网络”和主题模型技术进行挖掘分析,对孙桂芝老师治疗肝纤维化防治肝癌临床辨证施治特点及遣方用药规律进行深度解析,在此基础上,采用体内、外实验相结合方法,对孙桂芝治疗肝纤维化防治肝癌经验方“桃红芪术软肝煎”从阻断肝纤维化生成、TGF-β /Smad信号通路调节上皮间质转化实验研究,从一个侧面阐释孙桂芝老师学术思想的科学内涵。论文主要内容分为三部分：第一部分：对孙桂芝教授辨治肝纤维化/肝硬化,防治肝癌的学术思想及诊疗特点进行理论挖掘。从肝纤维化古今文献挖掘和临床跟师学习,深入领会孙桂芝老师治疗肝纤维化/肝硬化,防治肝癌的学术思想。1.基于孙桂芝老师的“未病先防”思想从“益气活血,软坚散结”“补益脾胃”治疗肝纤维化。2.孙桂芝老师认为肝癌的治疗应当以“益气活血软坚解毒”为治疗大法,常用黄芪建中汤、藤虎汤、活血利水方等治疗。第二部分 临床研究：对孙桂芝教授临床抗肝纤维化防治肝癌诊疗特点进行数据挖掘和疗效分析。分析35例既往有肝硬化/肝纤维化病史的原发性肝癌患者的临床信息,进行前瞻性分析,采用“无尺度网络”和主题模型技术挖掘,对孙桂芝老师临床辩治特点、遣方用药规律等进行进深入研究。1.临床疗效：患者客观疗效治疗后稳定率高于治疗前：乏力、神疲懒言、皮肤瘙痒、口干口苦、腹胀痛、急躁易怒、太息、胁痛、水肿等症状均有好转；谷丙转氨酶、谷草转氨酶、甲胎蛋白均下降；白蛋白较治疗前上升；红细胞、白细胞、血红蛋白、血小板均较治疗前升高；生命质量评分有明显提高。2.数据挖掘结果：在孙桂芝师诊治的35例肝癌伴肝纤维化／肝硬化的患者中,总结出位居前4位的证候-“核心证候”,同时,根据药物节点、紧密度及使用频次,总结出对应4个核心证候的4个“核心方剂”,其中,“气滞血瘀核心方剂”对应药物为：醋山甲、醋鳖甲、白芍、玫瑰花、绿鄂梅、陈皮、水红花子、地龙等。“毒邪侵袭核心方剂”对应药物为：虎杖、藤梨根、白花蛇舌草、重楼、土茯苓。“血瘀成积核心方剂”对应药物为：醋鳖甲、醋山甲、虎杖、水红花子、地龙、桃仁、鸡内金、莪术等。“脾肾不足核心方剂”对应药物为：黄芪、白芍、太子参、制何首乌、枸杞子、女贞子等。根据主题模型的研究,得出证候与中药对应的概率值较高的5组主题,分别是：心脾两虚证：多用太子参、当归、土茯苓、远志、麸炒白术等药物；毒邪侵袭证：常加用虎杖、重楼、醋龟甲等药物；气滞血郁证多用桃仁、地龙、醋鳖甲、蜈蚣等药物；血瘀成积证多用炮山甲、醋鳖甲等药物；脾肾不足证多用黄芪、制何首乌、白芍等药物；脾虚水停证常用生白术、猪苓、黄芪等药物。根据临床研究及数据挖掘技术,将数据结果与孙桂芝老师通过提交纸质文档、访谈探讨、审阅修改等方式,总结出孙桂芝老师治疗肝癌伴肝纤维化／肝硬化的经验方药,主要药物包括：生黄芪、炒白术、太子参、桃仁、莪术等药物。全方有健脾益气、活血化瘀、软坚消瘤之意,体现孙桂芝老师扶正培本、益气活血、软坚散结的临证诊治思路。第三部分体内及体外实验进行验证：揭示孙桂芝教授辨治肝纤维化临床疗效的分子机制,阐释孙桂芝经验的科学内涵。体内实验拟采用50%CCL4橄榄油溶液腹腔注射Wistar大鼠制备肝纤维化大鼠模型,制备肝纤维化模型,造模同时使用“桃红芪术软肝煎”低、中、高剂量干预治疗,并与和秋水仙碱、扶正化瘀胶囊进行对照观察。于造模给药3、6、9周3个时间点进行阻断肝纤维化进展的动态观察,和与TGF-β/Smad言号通路调节上皮间质转化直接相关指标的免疫组化蛋白表达和mRNA表达。体外实验选择Hep-G2作为低分化的肝脏干细胞,体外加人重组TGF-β蛋白干预,造体外肝纤维化模型,用“桃红芪术软肝煎”含药血清体外干预,免疫荧光法和Western Blot方法检测桃红芪术软肝煎对Hep-G2细胞相关蛋白表达量的影响。体内外实验相结合,探讨“桃红芪术软肝煎”治疗肝纤维化的疗效与机制,为阐释孙桂芝老师临床经验的科学内涵提供实验依据。1.体内实验疗效分析：1.1药物干预治疗后,不同时间节点大鼠肝纤维化程度比较第3、6、9周的大鼠肝脏HE染色及Masson染色提示：第3周大鼠肝脏组织发生部分纤维化,桃红芪术中剂量组及高剂量组改善最为明显；第6周模型组大鼠肝脏组织形成假小叶,提示造模成功,桃红芪术软肝煎及扶正化瘀胶囊、秋水仙碱对于大鼠肝纤维化均具有明显的缓解作用,桃红芪术高剂量组改善较其他组显著；第9周各组大鼠肝脏组织均形成假小叶,桃红芪术中剂量组及高剂量组肝组织结构改善最为明显。实验结果表明,随着造模给药时间的延长,各给药组均有阻断模型大鼠肝组织纤维化进展的功效。与模型对照组比,第9周时桃红芪术高剂量组作用最为明显。1.2不同时间节点大鼠肝组织免疫组化蛋白表达结果。第3、6、9周的大鼠肝脏免疫组化染色病理图片提示：与空白组相比较,模型组E-cadherin较空白组表达减弱,而TGF-β1、Vimentin、Smad2的表达较空白组表达增强,提示大鼠肝脏组织持续发生上皮间质转化,说明大鼠肝脏纤维化可能是通过发生上皮间质转发形成的；与模型对照组比,桃红芪术软肝煎可上调E-cadherin,下调TGF-β1及Vimentin.Smad2蛋白表达,提示桃红芪术软肝煎可能通过调节TGF-β/Smad信号通路,降低Smad2蛋白表达,从而下调TGF-β1,上调E-cadherin,下调Vimentin表达,发挥改善上皮间质转化,治疗肝纤维化的作用,其中以桃红芪术软肝煎中剂量组及高剂量组效果最为显著。1.3荧光定量PCR检测肝组织E-cadherin、TGF-β1、Vimentin、Smad2 mRNA表达：第3、6、9周大鼠肝脏组织mRNA表达说明：与空白组相比,模型组E-cadherin mRNA表达量下降,TGF-β1mRNA、Smad2 mRNA、Vimentin mRNA表达量上升,提示肝纤维化形成过程中,大鼠肝脏组织持续发生上皮间质转化,可能是通过TGF-β/Smad信号调节发生的：与模型对照组比,桃红芪术软肝煎可上调E-cadherinmRNA,下调TGF-β1mRNA及Vimentin mRNA表达、Smad2 mRNA表达,桃红芪术软肝煎各剂量组均有较好的疗效提示桃红芪术软肝煎可能通过调节TGF-β/Smad信号通路,影响调节上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT),发挥治疗肝纤维化作用。2.体外实验研究体外研究Hep-G2细胞,使用Recombinant Human TGF-β1诱导制作肝纤维化体外模型,从免疫荧光和Western Blot研究探讨桃红芪术软肝煎抗肝纤维化的分子机制。2.1免疫荧光结果显示：与空白组比较,模型组细胞E-cadherin表达减弱,Smad2、TGF-βR1、Vimentin表达增强；与模型组比,用药组可以上调E-cadherin表达,下调Smad2、TGF-βR1、 Vimentin表达,说明桃红芪术软肝煎低剂量组、桃红芪术软肝煎中剂量组、桃红芪术高剂量组及扶正化瘀胶囊组、秋水仙碱组均具有较好疗效。2.2 Western Blot蛋白定量分析显示：与空白组比较,模型组E-cadherin表达下降,Vimentin、TGF-βR1表达上升,说明体外肝纤维化细胞模型造模成功,并且Smad2表达增强,促进TGF-βR1表达增强,从而促进上皮间质转化；与模型组相比,桃红芪术低、中、高剂量组可以上调E-cadherin表达,下调Vimentin、TGF-βR1、Smad2表达,其中以桃红芪术软肝煎中剂量和高剂量组疗效最好,扶正化瘀胶囊和秋水仙碱也有相似疗效。体内实验从阻断肝纤维化组织病理变化,肝组织免疫组化蛋白表达、mRNA表达,以及体外实验Hep-G2细胞免疫荧光和Western Blot研究,均取得了比较一致的结果：经验方桃红芪术软肝煎抗肝纤维化疗效作用明显、肯定。研究结果从一个侧面阐释了孙桂芝老师治疗肝纤维化防治肝癌经验的理论内涵。本课题特色与创新之处：1.引入现代生物信息学技术,采用“无尺度网络”和“主题模型”技术分析对35例既往有肝纤维化／肝硬化病史的原发性肝癌,总结出“核心证候”对应的治则治法及“核心方药”,通过对孙桂芝老师临床学习、提交纸质文档、访谈探讨及审阅批改,对孙桂芝老师治疗肝纤维化的辨证特点、病因病机、治疗策略、遣方用药特点进行深层次解析,提出了孙桂芝老师治疗肝纤维化运用“益气活血,软坚散结”“补益脾胃”辨治原则和核心方药,为传承挖掘名老中医经验提供新思路。2.本研究采用大鼠肝纤维化模型和人Hep-G2细胞模型,体内外实验相结合,从肝纤维化病理组织形态、E-cadherin、Vimentin、Smad2、TGF-β1、TGF-βR1免疫组化蛋白及RT-PCR测定mRNA基因表达、体外检测中药含药血清干预诱导后E-cadherin、Vimentin、Smad2、TGF-βR1免疫荧光及Western Blot蛋白表达等,通过对经验方-“桃红芪术软肝煎”抗肝纤维化进行机制研究,探讨了名老中医治疗肝纤维化防治肝癌临床经验的科学性和理论的内涵,未见同类报道。