论文部分内容阅读
本论文主要开展了大肠杆菌(Escherichia coli)DH10B共代谢烟碱类杀虫剂吡虫啉(IMI)及降解条件的优化研究；利用同源重组系统敲除E.coli DH10B中与IMI硝基还原途径有关的基因；构建了嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)R551-3与IMI硝基还原途径相关基因的表达质粒并进行了异源表达。
在克隆和表达S.maltophilia R551-3的IMI硝基还原酶过程中,发现以琥珀酸钠为共代谢物,E.coli DH10B的静息细胞可降解IMI,而以蔗糖为共代谢物则IMI不降解。质谱分析显示以琥珀酸钠为共代谢物,E.coli DH10B可将IMI(=N-NO2)代谢为urea IMI(=O)产物。论文进一步考察共代谢物以及培养条件对E.coli DH10B降解IMI的影响。与S.maltophilia CGMCC1.1788和R551-3降解IMI相比,E.coli DH10B在酸性条件下几乎不降解IMI。通过转化条件优化,综合优化条件后,E.coli DH10B的urea IMI生成量和IMI降解量分别比优化前提高了92％和86％。
论文进一步开展了E.coli DH10B中与IMI硝基还原途径相关的酶的敲除研究。钼蛋白抑制剂甲萘醌抑制IMI的降解和urea IMI生成,表明IMI的代谢与钼蛋白有关。生物信息学分析显示E.coli DH10B蛋白组中与钼蛋白乙醛氧化酶相近的蛋白有YagR、XdhA和XdhD三个蛋白。采用pSC101-BAD—gbaA介导的同源重组对E.coliDH10B的VagR、XdhA和XdhD基因进行敲除,用HPLC检测IMI的降解。实验结果显示,通过red同源重组系统成功地分别敲除了YagR和XdhA基因,IMI降解试验表明,敲除YagR后的E.coli DH10B菌株的IMI降解量和urea IMI生成量分别减少30％和22％,显然YagR基因敲除后可减弱IMI的降解和urea IMI生成。XdhA基因敲除菌株的IMI代谢与对照组相同,因而可排除XdhA蛋白是IMI的硝基还原酶的可能。XdhD基因的敲除正在继续开展。
S.maltophilia是本实验室多年来一直用于研究IMI代谢的出发菌株。目前S.maltophilia R551-3的全基因组已公布。以琥珀酸为共代谢基质,该菌株可将IMI代谢为urea IMI、olefin IMI。在以蔗糖为共代谢基质,则抑制IMI的硝基还原途径。在该菌株的细胞质中添加琥珀酸可促进IMI的硝基还原,表明IMI的硝基还原酶是可溶性蛋白。参考有关文献以及公布的S.maltophilia R551-3菌株的全基因组,参与IMI硝基还原的酶可能是醌氧化还原酶(NQO)、羰基还原酶或乙醛氧化酶(AOX),所以对S.maltophilia R551—3中这三类酶进行了表达质粒的构建及目的蛋白的表达。本实验成功构建了smal_2429、2638、3642、1569、0358、0139和1991七个目的基因的pET-28a表达载体,可用于进一步研究IMI硝基还原酶的酶学特性等工作。