布鲁氏菌病(Brucellosis)是由胞内寄生的布鲁氏菌(Brucella)引起的一种重要的人兽共患病。该病可导致怀孕动物的流产,人的波浪热,流感样症状,以及骨关节炎等,对畜牧业生产以及人类健康造成严重危害。目前,布鲁氏菌的致病机制仍不明确,毒力相关基因的鉴定仍需进一步完成。本研究利用本实验室已构建的羊种布鲁氏菌NI转座子插入突变株文库,通过比较基因组学方法预测了布鲁氏菌必需基因,并通过细胞感染试验在全基因组水平筛选了毒力相关基因。取本实验室构建的布鲁氏菌(NI)株转座子突变株文库工作板分别灭活处理后,依次提取基因组、酶切基因组、将酶切产物自连接、反向PCR扩增连接产物、扩增产物测序,将获得的序列与羊种布鲁氏菌(NI)株全基因序列比对寻找转座子在基因组中的插入位点,最终从32,640个突变菌株文库中成功测序了 10,832株的转座子插入位点。从文库中随机选取20个已知插入位点的突变株按同样程序重新测序并分析转座子插入位点,验证符合率为100%,提示获得的插入位点信息准确性良好。分析插入位点数据发现,转座子插入位点均匀分布于布鲁氏菌(NI)株全基因组。在已知突变位点的10,832个突变株中,发现转座子插入在基因内有8,515株,其中5,330株(突变基因1,398个)的突变位点位于染色体Ⅰ, 3,185株(突变基因883个)的突变位点位于染色体Ⅱ;转座子插入在基因间隔有2,317株,其中1,643个突变株(转座子插入在723个基因间隔)插入位点在染色体Ⅰ,674个突变株(转座子插入在325个基因间隔)在染色体Ⅱ。在染色体Ⅰ和染色体Ⅱ序列中,分别平均每304 bp和305 bp被转座子插入1次,提示插入位点在已知突变株的覆盖率良好。随机转座子突变株文库中无转座子插入的基因,提示可能为该细菌生存的必需基因。对10,832个已知突变位点的突变株进行分析,发现在布鲁氏菌基因组中存在948个基因无转座子插入,将其作为布鲁氏菌候选基因。鉴于细菌必需基因在进化上相对保守,本研究通过比较基因组学从948个候选基因预测了 183个布鲁氏菌候选必需基因。该结果为进一步鉴定布病治疗新型药物的靶点奠定了基础。由于已知突变位点突变株中存在同位点插入和同基因多次插入现象,为了减少工作强度、提高鉴定效率,方便布鲁氏菌基因功能和致病机制研究,通过去除同位点插入和同基因多次插入的突变株,将6,782个已知突变位点的突变株在96孔板内按照次序重新布局排列,形成了覆盖B.melitensis NI株全基因组71%开放阅读框(Openreading frame, ORF)的布鲁氏菌突变株阵列。将突变株阵列分别感染鼠巨噬细胞,经荧光抗体染色观察初步用于布鲁氏菌毒力相关基因筛选,经两轮试验后获得275个影响布鲁氏菌胞内生存的基因。分析发现,其中121个基因为前期报道并已鉴定的布鲁氏菌毒力相关基因,154个基因为本研究首次筛选获得的潜在毒力基因(138个基因内,16个基因间隔,9个为基因内和基因间隔均存在)。综上所述,本研究获得的含有10,832个已知转座子插入位点的布鲁氏菌(NI)株突变株文库,将为全基因组水平研究布鲁氏菌基因功能和致病机制的研究提供便捷的资源。预测的183个布鲁氏菌后选必需基因将为鉴定布病治疗新型药物的靶点提供依据。新发现的154个布鲁氏菌毒力相关基因将为布鲁氏菌分子致病机制奠定基础。