肝癌是严重威胁人类健康的疾病,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一。过去数十年,虽然HCC的临床研究取得了很大进展,但对于肝癌的发病机制,仍然有很多空白。总的来说,肝癌的发生、发展都与肝细胞基因表达失控和蛋白调节紊乱有关。这些失调现象的积累,最终导致了肝癌的发生。因此,揭示和理清肝癌发生过程中基因表达失控和蛋白调节紊乱的原因,将有助于阐明肝癌的发生机制,从而研制有效的治疗方法。锌指蛋白是一类很重要的调控因子,参与众多关键的生物学过程,包括癌症的发生、发展。其中的RING指结构域是一种蛋白质相互作用的区域,既往研究提示拥有RING指的蛋白普遍具有两方面功能：①可参与基因转录调控、DNA修复和重组、细胞转化及肿瘤抑制等多种生物过程;ORING指区域是E3泛素蛋白连接酶的重要活性区域,许多含有RING指结构域的蛋白都在泛素化途径中起关键作用。RN181是一个新的C3HC4型锌指蛋白,基因全长716个碱基,编码153个氨基酸的蛋白,此蛋白含有一个RING指结构域。2008年Brophy等首次证实RN181具有E3酶活性。然而对于RN181的生理功能特别是在肿瘤中的作用,均是一片空白。因此,本研究以肝癌为研究对象,采用病毒表达与RNA干扰技术、蛋白质组学技术、免疫共沉淀等现代实验方法,对RN181的生理功能以及其在肝癌中的作用进行研究。方法：1,采用原核表达以及多步纯化的方法获得重组RN181蛋白；通过皮下免疫BALB/c小鼠制备针对RN181的多克隆抗体,并对该抗体进行了western blot和免疫组化验证。2,通过免疫组化结合组织芯片的方法,分析RN181在12种器官肿瘤中的表达。3,采用免疫组化的方法分析139对来自中山大学肿瘤医院和南方医科大学南方医院的临床肝癌组织,分析RN181在肝癌组织中的表达量与临床肝癌发生、发展的关系。4,用PCR法从pET28a/RN181重组质粒中扩增获得目的基因。经PCR和双酶切后,连接到逆转录病毒表达载体pLNCX2中,得到重组质粒pLNCX2-Flag/RN181,测序正确后与配套pVSV-G载体共转染GP2-293细胞包装得到重组逆转录病毒。重组病毒感染SMMC-7721细胞。感染后的细胞采用G418筛选3周,Western Blot验证后进行扩大培养、冻存,用于后续实验。用含RN181干扰片段的慢病毒(上海吉玛公司提供)感染SMMC7721、HepG2和Chang细胞,Real-Time PCR和WB验证获得阳性重组细胞,之后对这些细胞进行扩大培养、冻存,用于后续实验。5,用MTT法检测稳定高表达RN181和稳定干扰RN18的细胞的增殖状况：同时用软琼脂克隆形成实验检测细胞的体外克隆形成能力；用Transwell实验检查重组细胞的迁移能力；用裸鼠皮下接种成瘤的方法观察重组细胞在裸鼠体内的成瘤能力,并用免疫组化的方法分析瘤体中PCNA和actived-Caspase3的表达。6,2D/MALDI-TOF蛋白质组学的方法分析稳定高表达RN181的SMMC7721重组细胞与对照细胞的蛋白表达差异谱,从中获得的差异蛋白采用Osprey进行相互作用网络绘制,分析RN181可能参与的信号途径。另外,也采用了SILAC标记法对稳定干扰RN181的SMMC7721重组细胞及其对照细胞进行定量蛋白质组学差异表达谱分析。7,体内、外验证RN181参与这些信号通路的调控过程。8,免疫共沉淀寻找RN181在肝癌细胞中的相互作用蛋白。结果：1,通过纯化获得纯度大于90%的RN181重组蛋白;免疫小鼠,成功制备了特异针对RN181的多克隆抗体。该抗体能应用于Western Blot和免疫组化分析。2,通过对组织芯片分析,研究RN181在12种器官肿瘤中的表达。结果显示RN181表达于12种器官,RRN181低表达于肿瘤组织而高表达于相应癌旁组织。3,收集139例肝癌患者肝组织进行免疫组化分析,结果提示,RN181低表达于肝癌组织而高表达于相应癌旁组织(t=32.844,P<0.001)；且肝癌的分化程度越低,RN181的蛋白的表达量越低(F=132.783,P<0.001)。RN181的表达定位亦与肝癌的临床分期以及病理分级相关,而且临床分期或病理分级越高,RN181更倾向于定位在膜上。4,成功构建了高效表达RN181的逆转录病毒,感染肝癌细胞系SMMC-7721.用G418进行细胞筛选,Western Blot检测结果表明转染细胞中RN181的表达量明显增高,提示成功构建稳定表达RN181的肝癌细胞。5,成功构建了稳定干扰RN181的细胞株。用表达RN181干扰片段的重组慢病毒感染Chang、HepG2和SMMC7721细胞,流式细胞仪分选。Real-Time定量PCR(P<0.001)和Western Blot检测结果表明,转染后细胞中RN181的表达量明显减少,提示成功构建了稳定干扰RN181的细胞。6,采用MTT法检测稳定高表达RN181的SMMC7721细胞、稳定干扰RN181的SMMC7721细胞和相应对照细胞的生长情况,结果显示高表达RN181能抑制SMMC7721细胞的增殖(F=786.92,P<0.001)而干扰RN181则相反(F=255.26,P<0.001)。软琼脂克隆形成实验显示高表达RN181的稳定细胞株,其克隆形成能力明显低于对照组(t=6.742,P=0.001),而干扰RN181则相反(t=11.031,P<0.001)。这证实RN181能抑制肝癌细胞的生长能力。7,将各组肝癌细胞株注射至裸鼠前肢腋部皮下,成功构建裸鼠移植瘤模型。经观察移植瘤的生长速度,发现注射稳定高表达RN181肝癌细胞的裸鼠,与对照组裸鼠相比较,瘤体生长速度慢；而注射稳定干扰RN181细胞的裸鼠则表现相反：高表达RN181的SMMC7721细胞与相应对照细胞SMMC7721/empty相比较,成瘤能力显著下降,平均差值=-0.69,P=0.017；干扰下调RN181的SMMC7721细胞与相应对照细胞SMMC7721/NC相比较,平均差值=1.01,P=0.013；同样,干扰下调RN181的Chang细胞与相应对照细胞Chang/NC相比较,平均差值=1.06,P=0.007；干扰下调RN181的HepG2细胞与相应对照细胞HepG2/NC相比较,平均差值=1.63,P<0.001。免疫组化分析显示,PCNA高表达于稳定干扰组瘤体而低表达于稳定高表达组瘤体,actived-Caspase3的表达则相反：高表达组SMMC7721/RN181与对照组SMMC7721/empty比较,PCNA的表达量显著低于对照组(均数差值=-3.17,P<0.001),actived-Caspase3的表达量显著高于对照组(均数差值=3.67,P<0.001)；而干扰组SMMC7721/KD与相应对照组SMMC7721/NC比较,PCNA的表达量显著高于对照组(均数差值=7.50,P＜0.001), actived-Caspase3的表达量显著低于对照组(均数差值=-2.83,P<0.001)。8,二维电泳结合MALDI-TOF质谱分析高表达RN181细胞组,获得39个差异表达蛋白,高表达RN181能明显下调多个促癌蛋白的表达。相互作用蛋白网络分析这些差异蛋白,发现很多集中在MAPK-ERK途径中。9,体外细胞Western Blot检测p-ERK的表达,发现高表达RN181能抑制ERK的磷酸化,而干扰RN181的表达则相反；裸鼠瘤体的免疫组化分析亦显示,高表达组ERK磷酸化程度低于对照组,而干扰组则相反：SMMC7721/RN181和SMMC7721/empty比较,ERK磷酸化水平明显受到抑制(P=0.01); SMMC7721/KD和SMMC7721/NC比较,ERK磷酸化水平明显增高(P<0.001)；而且Chang/KD和Chang/NC比较,ERK磷酸化水平也明显增高(P<0.001)。对40对临床标本进行RN181和p-ERK表达的相关性分析,RN181在癌中的表达量要显著低于癌旁组织,平均差值=-5.38,P<0.001,而pERK在癌中的表达量要显著高于癌旁组织,平均差值=4.08,P<0.001；pERK在癌组织中的表达与RN181在癌组织中的表达呈负相关(r=-0.324,P=0.042),而pERK在癌旁中的表达则与RN181在癌旁中的表达无相关性(r=-0.136,P=0.403)。体外MAPK-ERK通路抑制实验显示,在稳定干扰RN181的细胞中抑制ERK的磷酸化,能有效抑制肝癌细胞的增殖(加药组之间的比较无差异,P=0.94)和平板克隆形成能力(加药组之间的比较无差异,P=0.77)。10, Transwell转移实验显示,无论是高表达还是干扰RN181均能在体外抑制肝癌细胞的迁移能力。11,通过SILAC标记法分析干扰RN181细胞组的差异蛋白,并对这些差异蛋白进行相互作用蛋白网络分析,除发现包含有MAPK-ERK途径,还发现RN181能参与细胞骨架蛋白的调控。12, F-actin免疫荧光检测干扰下调RN181的肝癌细胞的细胞骨架,结果发现RN181的下调促进了F-actin的聚集：在RN181下调的SMMC7721细胞中,F-actin的染色呈现出明显的条状和成簇分布,而对照细胞则无此现象,F-actin的染色是散在的,而且表达量低。13,采用Western Blot的方法检测RN181干扰后的细胞参与细胞骨架重排的蛋白分子的表达。结果显示,干扰RN181后,细胞骨架调控蛋白cofilin的磷酸化水平明显提高,而cofilin蛋白本身的表达水平并没有变化；另外,干扰RN181后,另一个细胞骨架调控蛋白VASP的表达量也升高了。14,免疫共沉淀分析发现,RN181与多个肿瘤相关蛋白相互作用。这些蛋白能调控细胞的凋亡、骨架重组、转录调控和翻译调控。其中就包括了HSP90a, HSP90b和RPS3蛋白。多个相互作用蛋白组成的网络图包含了ERK径和actin重排。Western Blot验证蛋白HSP90a, HSP90b和RPS3在重组细胞SMMC7721/NC和SMMC7721/KD中的表达。结果发现这三个蛋白在重组细胞中的表达量均没有变化,这一结果与基于SILAC定量组学分析的结果一致。结论：RN181低表达于临床癌组织而高表达于相应正常组织,在临床肝癌样本中,RN181的表达与肝癌的分化程度相关——RN181表达量越高,肝癌组织分化程度越高。RN181的表达分布也与肝癌的发生、发展相关。高表达RN181可抑制肝癌细胞的增殖、降低其克隆形成能力和裸鼠成瘤能力,而干扰RN181则相反。RN181在临床肝癌样品中的表达与ERK的磷酸化程度成反比。体外抑制实验显示,在稳定干扰RN181的细胞中抑制ERK磷酸化,能抑制肝癌细胞的增殖、平板克隆形成能力。由此可见,RN181能通过调节MAPK-ERK途径抑制肝癌细胞生长。然而在另一方面,RN181也能调节肝癌细胞的转移能力。无论高表达RN181还是下调RN181的表达都能够抑制肝癌细胞的体外转移能力。RN181的相互作用蛋白并没有像想象中的那样被降解。从以上结果显示,RN181在调节肝癌的发生、发展过程中具有复杂的功能,它的这种功能可能是通过修饰底物蛋白而不是降解底物蛋白来实现的。